[发明专利]一种两步酶法制备(R)-N-(2,6-二甲基苯基)氨基丙酸甲酯的方法

权利要求书

1.一种两步酶法制备(R)-N-(2,6-二甲基苯基)氨基丙酸甲酯的方法，其特征在于所述方法按如下步骤进行：(1)以固定化酯酶PAE为催化剂，以(R,S)-N-(2,6-二甲基苯基)氨基丙酸甲酯为底物，以水为溶剂，在30-40℃反应完全，将反应液离心，收集上清液；向上清液中加入乙酸乙酯进行萃取，萃取后得到乙酸乙酯层和水层；取乙酸乙酯层旋蒸至干，回收得到乙酸乙酯和(S)-N-(2,6-二甲基苯基)氨基丙酸甲酯；水层使用4M的HCl水溶液调节pH至2，加入乙酸乙酯进行萃取，回收乙酸乙酯层并用水重复萃取1-3次，再次回收乙酸乙酯层，旋蒸至干，回收乙酸乙酯，同时得到(R)-2,6-二甲基苯基氨基丙酸；所述固定化酯酶PAE是将含SEQ ID NO.1所示酯酶PAE基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体超声破碎提取纯酶液；再将纯酶液以四甲氧基硅烷为载体，以聚乙烯亚胺为交联剂制备固定化酯酶PAE；(2)将步骤(1)制备的(R)-2,6-二甲基苯基氨基丙酸与脂肪酶、无水甲醇、水和正己烷混合，在30-60℃反应2-14h，反应液分离出正己烷相之后的溶液旋蒸浓缩，得到(R)-N-(2,6-二甲基苯基)氨基丙酸甲酯。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)中固定化酯酶PAE按如下步骤制备：1)纯酶液：将含SEQ ID NO.1所示酯酶PAE基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体超声破碎提取纯酶液；2)固定化：将四甲氧基硅烷和1mmol/L的HCl水溶液按体积比1：1混合，在磁力搅拌器的作用下200rpm搅拌0.5-2h，得到1mol/L的硅前体溶液；在室温下，将pH 7.0硅前体溶液、pH 7.0的1g/L聚乙烯亚胺水溶液和步骤1)制备的酯酶PAE纯酶液进行等体积混合，在磁力搅拌器的作用下200rpm反应2-10min后，在5000rpm下离心5min，沉淀使用pH 7.2、50mM的PBS缓冲液冲洗除去未被包裹的酯酶酶液和过量的反应液，将洗涤后的沉淀物在-60℃、100Pa冷冻干燥，得到固定化酯酶PAE。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)中底物用水溶解制成0.1-5mol/L底物溶液，所述底物溶液体积用量以催化剂重量计为50-500mL/g。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于步骤1)纯酶液按如下方法制备：将含SEQ IDNO.1所示酯酶PAE基因的工程菌接种至LB培养基，37℃培养16h后，转接至LB培养基，37℃培养至OD600＝0.6，以体积浓度1％的接种量接种至发酵培养基，在24℃、200rpm条件下培养10h，发酵液在4℃、12000rpm下离心10min，收集湿菌体；将湿菌体以0.1g/ml的量加入PB缓冲液中，在300W条件下超声破碎20min，每破碎1s间隔1s，即得到细胞破碎悬液；细胞破碎悬液12000rpm 4℃下离心10min，上清液即是粗酶液；取粗酶液上样至预平衡Ni-NTA金属螯合亲和层析柱中，使用AKTA蛋白纯化仪依次用含5mM咪唑、40mM咪唑、100mM咪唑、150mM、250mM咪唑的PBS缓冲液洗脱杂蛋白和目的蛋白；收集150mM咪唑PBS缓冲液的流出液，获得目的蛋白并用pH 8.0、50mM Tris-HCl缓冲液通过超滤浓缩脱盐，所得的脱盐酶液即是酯酶PAE的纯酶液。

5.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述含SEQ ID NO.1所示酯酶PAE基因的工程菌是将SEQ ID NO.1所示酯酶PAE基因连接到载体pAEASY-blunt-E1上，导入E.coli BL-21(DE3)感受态中表达，构建基因工程菌E.coli BL-21(DE3)/pAEASY-blunt-E1。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)中所述脂肪酶为固定化脂肪酶Novozym TLIM、固定化脂肪酶Novozym 435、固定化脂肪酶Lipase PS-IM、固定化脂肪酶Lipozyme RM、固定化脂肪酶CALB。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)中(R)-2,6-二甲基苯基氨基丙酸与脂肪酶质量比为1：0.05-1；所述水的添加量以(R)-2,6-二甲基苯基氨基丙酸质量计为0.1-1.0ml/g；所述正己烷的添加量以(R)-2,6-二甲基苯基氨基丙酸质量计为4-12ml/g；所述无水甲醇体积用量以(R)-2,6-二甲基苯基氨基丙酸质量计为1-5ml/g。