[发明专利]基于牛纳米孔测序技术的原核生物核糖核酸直接测序方法

说明书

本发明公开了基于牛纳米孔测序技术的原核生物核糖核酸直接测序方法，包括如下步骤：步骤一：原核生物RNA的3′端添加聚腺苷酸(polyA)序列；步骤二：RNA直接测序文库构建；步骤三：使用纳米孔测序仪测序；本发明属于生物技术领域，具体是基于牛纳米孔测序技术的原核生物核糖核酸直接测序方法，利用大肠杆菌聚腺苷酸聚合酶在原核生物核糖核酸(RNA)的3’末端无差别添加聚腺苷酸(polyA)序列，由此使其可使用核糖核酸(RNA)直接测序试剂进行文库构建并实现最终的直接测序。解决了牛津纳米孔核糖核酸(RNA)直接测序试剂盒无法适配不带有聚腺苷酸的核糖核酸(RNA)的直接测序问题，扩大了核糖核酸(RNA)直接测序试剂盒的应用范围。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体是指基于牛纳米孔测序技术的原核生物核糖核酸直接测序方法。

背景技术

对生物样本中的核糖核酸(RNA)进行测序可以获得丰富的信息，包括细菌和病毒的身份、选择性剪接的细微差别或生物体的转录状态。随着核糖核酸(RNA)的重要性逐渐被人所认识，研究人员也开发出多种方法来研究它。然而，目前大多数的“核糖核酸(RNA)测序”技术只能产生相对较短的读取长度，并且多数方法仍需将核糖核酸(RNA)反转录成互补脱氧核糖核酸(cDNA)，而这一步不仅会引入错误及偏好，且效率不高，还会阻止核糖核酸(RNA)本身结构复杂性的有效表征。

基于二代高通量测序和美国太平洋生物三代测序平台的核糖核酸(RNA)测序技术，均是通过将信使核糖核酸(mRNA)反转录成互补脱氧核糖核酸(cDNA)并扩增后完成测序，因此存在必然的序列偏好，且无法实现信使核糖核酸(mRNA)复杂性的直接鉴定。牛津纳米孔技术因其独特的测序原理，能够直接测序天然全长核糖核酸(RNA)分子，从根本上突破了之前读取长度较短以及反转录或扩增偏好而存在的局限性，并且能够直接获得核糖核酸(RNA)序列上的碱基修饰信息。

牛津纳米孔测序技术能够提供高度灵活、可扩展的长读长核糖核酸(RNA)测序方法，即当脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、蛋白质和小分子等穿过蛋白纳米孔时会引起离子电流的变化，传感器通过记录这些离子电流的变化来完成测序。牛津纳米孔技术独特的测序原理使其测序过程无需酶促合成反应参与，从而使脱氧核糖核酸(DNA)/核糖核酸(RNA)分子直接测序成为现实。在测序过程中，用于核糖核酸(RNA)直接测序的试剂盒提供了对全长非扩增核糖核酸(RNA)链进行测序的唯一方法，无需转换为互补脱氧核糖核酸(cDNA)，可进行序列以及碱基修饰的分析。牛津纳米孔测序技术-直接核糖核酸(RNA)测序技术在新的核糖核酸(RNA)异构体以及核糖核酸(RNA)碱基修饰的鉴定和功能表征方面具有优势。但是，目前牛津纳米孔测序技术公司推出的直接核糖核酸(RNA)测序试剂盒由于其内置组分-反转录接头(RTA)的序列仅带有胸腺嘧啶重复寡核苷酸(oligo dT)序列，因此仅适配3’端带有聚腺苷酸(polyA)序列的核糖核酸(RNA)测序。而对于3’端不含聚腺苷酸(polyA)序列的原核生物核糖核酸(RNA)以及病毒核糖核酸(RNA)等核糖核酸样本，该流程无法直接使用。

发明内容

针对上述情况，为克服现有技术的缺陷，本发明提供的基于牛纳米孔测序技术的原核生物核糖核酸直接测序方法，利用大肠杆菌聚腺苷酸聚合酶在原核生物核糖核酸(RNA)的3’末端无差别添加聚腺苷酸(polyA)序列，由此使其可使用核糖核酸(RNA)直接测序试剂进行文库构建并实现最终的直接测序。解决了牛津纳米孔核糖核酸(RNA)直接测序试剂盒无法适配不带有聚腺苷酸的核糖核酸(RNA)的直接测序问题，扩大了核糖核酸(RNA)直接测序试剂盒的应用范围。

本发明采取的技术方案如下：本发明基于牛纳米孔测序技术的原核生物核糖核酸直接测序方法，包括如下步骤：

步骤一：原核生物RNA的3′端添加聚腺苷酸(polyA)序列