[发明专利]富含次生代谢物的植物组织中DNA的提取方法

说明书

本发明公开了一种富含次生代谢物的植物组织中DNA的提取方法。该提取方法包括干扰物处理、组织细胞裂解、盐析、DNA沉淀和清洗步骤，其中，干扰物处理步骤包括：将植物组织同交联聚乙烯吡咯烷酮一起研磨；以及加入漂洗液对研磨后的植物组织进行干扰物漂洗处理；其中，漂洗液包括：100～500mM Tris‑Hcl pH＝4.8、0.35～0.5M山梨醇、5～10mM EDTApH＝4.8、1～5％PVP和0.5～2％巯基乙醇。应用本发明的技术方案，可以实现快速高效的提取出高质量DNA。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种富含次生代谢物的植物组织中DNA的提取方法。

背景技术

近些年，随着生物测序技术的迅猛发展，无论是科研人员还是普通广大民众都开始享受该技术带来的一系列红利。尤其是随着新型冠状病毒的爆发，生物测序技术在医学及病毒检测防疫的应用中起到举足轻重的作用，让人民看到了生物测序技术的强大作用。不仅如此，在动植物研究及生产上该技术更是应用广泛。

在测序技术中，能够得到高质量DNA对于后期建库测序和数据分析乃至后期应用都起到关键作用。很多植物组织富含多糖多酚等次生代谢产物影响着提取DNA的质量和产量，阻碍了后续应用进展。目前DNA提取方法众多，如CTAB(Cetyl-trimethyl-ammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化铵)法、高盐低pH法、SDS(Sodium dodecyl sulfate，十二烷基硫酸钠)法、苯酚法和提取试剂盒的使用等。但是，对于含有大量多糖多酚等次生代谢产物的植物，采用常规的方法很难提取出高质量的DNA。

CTAB是一种高效的阳离子去污剂，可破碎细胞壁和细胞膜，具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。在高离子强度的溶液中(0.7mol/L NaCl)，CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。CTAB法是目前应用最广泛发展较成熟的方法，最大优点就是除去多糖。可是常规CTAB提取法去除杂质效果有限，往往达不到我们所需要的DNA质量要求，因而需要针对现有的常规CTAB提取法进行改良，达到提取出高质量DNA的目的。

发明内容

本发明旨在提供一种富含次生代谢物的植物组织中DNA的提取方法，从而实现快速高效的提取出高质量DNA。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种富含次生代谢物的植物组织中DNA的提取方法。该提取方法包括干扰物处理、组织细胞裂解、盐析、DNA沉淀和清洗步骤，其中，干扰物处理步骤包括：将植物组织同交联聚乙烯吡咯烷酮一起研磨；以及加入漂洗液对研磨后的植物组织进行干扰物漂洗处理；其中，漂洗液包括：100～500mM Tris-Hcl pH＝4.8、0.35～0.5M山梨醇、5～10mM EDTA pH＝4.8、1～5％PVP和0.5～2％巯基乙醇。

进一步地，盐析包括：在组织细胞裂解后加入裂解液体积1/5-1/2的3M醋酸钾溶液pH＝4.8进行盐析处理。

进一步地，提取方法具体包括以下步骤：S1，将植物组织在预冷的研磨管中利用研磨器研磨成粉末状，研磨前研磨管中加入有交联聚乙烯吡咯烷酮粉末；S2，加入漂洗液对研磨后的植物组织进行干扰物漂洗处理，混匀离心弃上清液；S3，向研磨管中加入2～5％CTAB裂解液，混匀，使植物组织悬浮，水浴，取出后，室温静置，离心取上清；S4，向S3中得到的上清中加入3M醋酸钾溶液pH＝4.8，醋酸钾的加入量是上清液体积的1/5～1/2，离心取上清；S5，向S4中得到的上清中加入等体积苯酚/氯仿/异戊醇抽提后取上清、然后加入等体积氯仿/异戊醇抽提后取上清；S6，向S5中得到的上清中加入异丙醇进行DNA沉淀，弃上清；S7，利用75％乙醇清洗DNA沉淀；S8，DNA沉淀干燥后加入洗脱缓冲液溶解DNA沉淀，加入RNase A酶消化RNA。

进一步地，S2中的离心力为2500g～3000g，离心时间为10～15min，S2重复2次或2次以上。