[发明专利]一株产肝素酶的基因工程菌及其在制备小分子肝素中的应用

说明书

本发明公开了一株产肝素酶的基因工程菌及其在制备小分子肝素中的应用，属于生物工程技术领域。本发明将来源于普通变形杆菌Pedobacter heparinus ATCC13125的肝素酶进行异源表达，选取信号肽amyQ，pHT01载体，通过乳糖或异丙基‑β‑D‑硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导，实现了肝素酶在枯草芽孢杆菌中的分泌表达，并通过设计的肝素酶‑酶膜反应器实现了小分肝素的高效连续生产，并使肝素酶得到了循环利用，大大降低了生产成本。本发明以食品级枯草芽孢杆菌作为宿主菌株，安全可靠，为工业化绿色生产小分子肝素的提供了有效的参考与借鉴，同时节能减排，经济效益和社会效益显著。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一株产肝素酶的基因工程菌及其在制备小分子肝素的方法。

背景技术

肝素是天然的抗凝药物。在医学上广泛用作医用介入设备。此外，肝素与体外循环作为化疗药物和抗炎药物的助剂、生长因子的调节剂，肝素被用于治疗血液动力学紊乱、肠炎疾病、癌症、静脉血栓等疾病。

肝素具有聚合结构，因而肝素组合物通常包含分子量通常为5kDa～40kDa的肝素。小分子肝素的分子量一般为3kDa～8kDa，平均分子量为5kDa左右。与肝素相比，低分子肝素能被更好地被吸收，并且可以进行皮下给药；在血流中保留更长的时间；具有更可预测的临床响应。因此，制备小分子肝素具有重要意义。

制备小分子肝素方法有物理降解法、化学降解法和酶解法。物理法主要为加热、机械剪切、超声波破碎和、γ-射线辐照等，可促使硫酸软骨素和透明质酸发生降解。虽然物理降解法处理过程简单，产品易于回收，但是存在一定的缺陷，例如加热法易使产品变色，超声效率较低，γ-射线辐照残留，且产品的稳定性差、分子量范围较大。化学降解方法有水解法和氧化降解法，水解法包括酸水解和碱水解，氧化降解常用的氧化剂为次氯酸钠和过氧化氢。但是，化学降解法引入了化学试剂，反应条件复杂，易给产品的生物活性带来影响和产品的纯化带来困难，且产生大量的工业废水。而酶法降解由于其反应条件温和、便于检测以及生物活性保持较好等特点，成为近年来小分子肝素的研究的热点。

发明内容

本发明需要解决的技术问题是，提供一种产肝素酶的枯草芽孢杆菌基因工程菌，实现了肝素酶的分泌表达，解决了肝素酶以包涵体存在的生产问题

本发明还要解决的技术问题是，提供上述产肝素酶的枯草芽孢杆菌基因工程菌的构建方法。

本发明最后解决的技术问题是，提供上述产肝素酶的枯草芽孢杆菌基因工程菌在制备小分子肝素中的应用。

为解决以上技术问题，本发明采用如下技术方案：

一株产肝素酶的枯草芽孢杆菌基因工程菌，该基因工程菌中导入了肝素酶基因，所述肝素酶基因前具有扩增信号肽amyQ基因，所述肝素酶基因的核苷酸序列如SEQID NO.1所示，所述扩增信号肽amyQ基因的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。

上述产肝素酶的枯草芽孢杆菌基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1s)将扩增信号肽amyQ基因与肝素酶Hap基因连接，得到重组基因片段；

(2s)将重组基因片段克隆到pHA01质粒中，得到重组质粒；

(3s)将重组质粒转化枯草芽孢杆菌，得到产肝素酶的枯草芽孢杆菌基因工程菌。

其中，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis WB600-△spoOA或者B.subtilis WB800-△spoOA。

一步法高效制备小分子肝素的方法，该方法包括如下步骤：

(1)基因工程菌的构建：