[发明专利]一种改进的基于CRISPR技术检测靶核酸的方法

说明书

本发明提供了一种改进的基于CRISPR技术检测靶核酸的方法，具体地提供了一种改进的基于CRISPR技术检测样品中靶核酸的方法，所述靶核酸具有5’至3’端依次连接的第一区段和第二区段，所述方法包括将样品与Cas12b、经改造的tracrRNA、DNA和单链核酸检测器接触；所述DNA能够与所述靶核酸的第二区段杂交；所述经改造的tracrRNA根据能够与Cas12b相互作用的野生型tracrRNA和crRNA所形成的复合结构进行改造，以使得所述经改造的tracrRNA的3’端可以和所述靶核酸的第一区段互补配对从而形成类似野生型tracrRNA和crRNA互补配对所形成的复合结构以指导Cas12b靶向所述DNA；检测由所述Cas12b切割单链核酸检测器产生的可检测信号，从而检测所述靶核酸。

技术领域

本发明涉及核酸检测领域，具体地，涉及一种改进的基于CRISPR技术检测靶核酸的方法，尤其涉及一种改进的基于CRISPR技术检测靶核酸的方法、系统和试剂盒。

背景技术

特异性检测核酸分子(Nucleic acid detection)方法具有重要的应用价值，例如病原体的检测，遗传病检测等。在病原体检测方面，由于每种病原体微生物都有其独一无二的特征核酸分子序列，因此可以开发出针对特定物种的核酸分子检测，也称为核酸诊断(NADs,nucleic acid diagnostics)，在食品安全、环境微生物污染检测，人体病原菌感染等领域具有重要义。

目前建立的特异性核酸分子检测通常需要分为两步，第一步是目的核酸的扩增，第二步是目的核酸检测。现有检测技术包括限制性核酸内切酶方法、Southern、Northern、斑点杂交、荧光PCR检测技术、LAMP环介导等温扩增技术、重组酶聚合酶扩增技术(RPA)等方法。2012年之后，CRISPR基因编辑技术兴起，张锋团队基于RPA技术开发了一种以Cas13为核心的靶向RNA的新核酸诊断技术(SHERLOCK技术)，Doudna团队开发了一种以Cas12酶为核心的诊断技术(DETECTR技术),中国科学院上海植物生理生态研究所王金博士等也开发了一种基于Cas12的新型核酸检测技术(HOLMES技术)。基于CRISPR技术开发的核酸检测技术正在日益发挥重要作用。

目前，基于Cas酶的核酸检测技术，一般是通过对gRNA的靶向区进行设计从而可以适用于不同靶核酸的检测，例如，CN109837328A和CN110551800A公开的基于Cas12b的核酸检测技术。

本发明对基于Cas酶的核酸检测技术的检测方案进行了改进，从而提供了一种改进的基于CRISPR技术的核酸检测方法，扩展了该技术的应用空间。

发明内容

本发明基于Cas12b，提供了一种改进的靶核酸检测方法。

本领域知晓，Cas12b需要在gRNA(指导RNA)的作用下靶向靶序列，gRNA包括tracrRNA以及crRNA；tracrRNA的3’端能够与crRNA的5’端形成配对区，crRNA的3’端包括与靶序列杂交的区域；例如，现有技术(“Engineering of CRISPR-Cas12b for human genomeediting”，Jonathan Strecker等，NATURE COMMUNICATIONS，2019，10：212)以及(Repurposing CRISPR-Cas12b for mammalian genome engineering，Teng et al.CellDiscovery，2018，4：63)均记载了tracrRNA和crRNA所形成的复合结构。

在一个实施方式中，本申请提供了一种检测样品中靶核酸的方法，所述靶核酸具有5’至3’端依次连接的第一区段和第二区段，所述方法包括将样品与Cas12b、经改造的tracrRNA、DNA和单链核酸检测器接触；

所述DNA能够与所述靶核酸的第二区段杂交；