[发明专利]一种高产乳酰-N-四糖的微生物的构建方法及应用

说明书

本发明公开了一种高产乳酰‑N‑四糖的微生物的构建方法及应用，属于微生物基因工程领域。本发明以前期构建完成的高效生产前体物质乳酰‑N‑三糖II的菌株为出发菌株，过表达合成乳酰‑N‑四糖的关键基因，使其拥有生产乳酰‑N‑四糖的合成能力。本发明通过筛选高效的β‑1,3‑半乳糖基转移酶基因，并合理设计在载体pCDFDuet‑1上共表达β‑1,3‑半乳糖基转移酶基因和强化UDP‑半乳糖途径关键基因UDP‑葡萄糖4差向异构酶基因(galE)，从而提高乳酰‑N‑四糖的合成，在摇瓶实验中，大肠杆菌生产乳酰‑N‑四糖的能力为3.04g/L，在3L发酵罐中，乳酰‑N‑四糖的产量达到25.49g/L，具备工业应用的前景。

技术领域

本发明涉及一种高产乳酰-N-四糖的微生物的构建方法及应用，属于微生物基因工程领域。

背景技术

母乳寡糖(HMOs)被研究证实具有调节婴幼儿肠道微生物群平衡，促进新生儿大脑早期发育，提高免疫力等独特的生理功能。而HMOs的主要成分之一乳酰-N-四糖是HMOs重要的二十种核心结构之一，以其为核心单元，可经过岩藻糖基化和唾液酸化制备多种母乳寡糖。因此，LNT的高效制备对多种HMOs的大量合成具有重要作用。但是目前乳酰-N-四糖和乳酰-N-新四糖的生产成本较高且生产方法有一定局限性。尤其是乳酰-N-四糖的生产，目前研究的较少，不管是对于乳酰-N-四糖的功能研究还是产物合成研究。

目前乳酰-N-四糖可以通过化学合成和生物合成获得。化学法合成通常需要引入保护基团，步骤繁冗，且存在保护不到位，后续脱除不彻底及发生其他副反应的问题，而且常需要使用有毒有害试剂。相比之下，生物法合成由于酶与底物的特异性高，底物廉价，合成步骤简化，副产物少，产率大大提高，更适合大规模的工业化生产。目前用的酶法生产乳酰-N-四糖需要的关键的编码β-1,3-半乳糖基转移酶基因来源于紫色杆菌(Chromobacteriumviolaceum)，利用一锅酶法策略，使得乳酰-N-四糖产量达到130mg。另一个已报道的编码β-1,3-半乳糖基转移酶基因来源于大肠杆菌O55:7，并已经用于微生物发酵高产乳酰-N-四糖。Albermann团队通过染色体整合了来源脑膜炎双球菌(Neisseriameningitidis)的编码β-1,3-N-乙酰氨基葡萄糖氨基转移酶的lgtA基因和来源的编码β-1,3-半乳糖基转移酶的wbgO基因，高效产生乳酰-N-四糖，在发酵罐中的最高滴度为12.72g/L(Conrad J,Sprenger GA,et al.Synthesis of the human milkoligosaccharide lacto-N-tetraose in metabolically engineered,plasmid-freeE.coli.ChemBioChem.2014；15(13):1896-1900.和Sprenger GA,AlbermannC.Galactose-limited fed-batch cultivation of Escherichia coli for theproduction of lacto-N-tetraose.Enzyme Microb Tech.2015；75-76:37-43.)。相比于酶法合成，以微生物发酵法合成乳酰-N-四糖更加高效和安全。但目前使用的微生物方法合成的乳酰-N-四糖产量均较低，目前已报道的β-1,3-半乳糖基转移酶可能是一个限制因素，都不能达到工业化大规模生产的要求，因此，为了解决目前微生物生产的瓶颈，打造更高效的生产菌株是非常必要的。

发明内容

为了解决目前存在的问题，本发明从诸多糖基转移酶中筛选到了一种来源于P.ferrooxidans的糖基转移酶，该酶可以乳酰-N-三糖II和UDP-半乳糖为底物，生产乳酰-N-四糖，因而将其命名为β-1,3-半乳糖基转移酶，将此酶应用于乳酰-N-四糖的生产，产量较现有报道的其他的β-1,3-半乳糖基转移酶有显著提升。