[发明专利]一种高产乳酰-N-四糖的微生物的构建方法及应用有效
| 申请号： | 202110900124.5 | 申请日： | 2021-08-06 |
| 公开（公告）号： | CN113652385B | 公开（公告）日： | 2023-10-03 |
| 发明（设计）人： | 沐万孟;张文立;朱莺莺;李泽宇 | 申请（专利权）人： | 江南大学 |
| 主分类号： | C12N1/21 | 分类号： | C12N1/21;C12N9/10;C12N9/12;C12N15/61;C12N15/55;C12N15/56;C12N15/70;C12P19/26;C12P19/18;C12R1/19 |
| 代理公司： | 哈尔滨市阳光惠远知识产权代理有限公司 23211 | 代理人： | 赵巧娜 |
| 地址： | 214000 江苏*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 高产 微生物 构建 方法 应用 | ||
1.一种重组大肠杆菌，其特征在于，表达氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示的β-1,3-半乳糖基转移酶，过表达葡萄糖胺合成酶、UDP-乙酰葡萄糖胺焦磷酸化酶和葡萄糖胺-6-磷酸合成酶和β-1,3-乙酰葡萄糖胺转移酶，并敲除编码UDP-N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶的基因、编码葡萄糖胺-6磷酸脱氨酶的基因和编码β-半乳糖苷酶的基因。
2.根据权利要求1所述的大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌中含有表达载体pCDFDuet-1，所述表达载体含有编码β-1,3-半乳糖基转移酶的基因。
3.根据权利要求1或2所述的大肠杆菌，其特征在于，含有表达载体pRSFDuet-1和pETDuet-1；所述表达载体pRSFDuet-1上含有编码葡萄糖胺合成酶、UDP-乙酰葡萄糖胺焦磷酸化酶和葡萄糖胺-6-磷酸合成酶；所述表达载体pETDuet-1上含有β-1,3-乙酰葡萄糖胺转移酶的基因；所述pRSFDuet-1上的核糖体结合位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；所述pETDuet-1的核糖体结合位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
4.一种生产乳酰-N-四糖的方法，其特征在于，利用权利要求1～3所述的重组大肠杆菌为发酵菌株。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，将所述重组大肠杆菌培养12～14h得到种子液，将种子液按反应体系体积的2～5％加入含有甘油的反应体系中，35～40℃震荡培养至OD600为0.6-0.8，向反应体系中加入终浓度为0.1～0.2mM的IPTG，在22～25℃诱导培养不低于90h。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，将所述重组大肠杆菌培养12～14h得到种子液，将种子液按反应体系体积的2～5％加入反应体系中，35～40℃震荡培养至OD600为14±3，向反应体系中加入终浓度为0.1～0.2mM的IPTG，和终浓度为5～10g/L的乳糖，在22～25℃诱导培养不低于40h。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，反应过程中维持乳糖浓度不低于6g/L，甘油浓度不低于10g/L。
8.氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示的β-1,3-半乳糖基转移酶在生产乳酰-N-四糖中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，以乳酰-N-三糖II和UDP-半乳糖为底物，利用所述β-1,3-半乳糖基转移酶，生产乳酰-N-四糖。
10.权利要求1～3任一所述重组大肠杆菌在食品、生物、化工领域中的应用。
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