[发明专利]一种耐盐β-半乳糖苷酶GalNC2-13及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种耐盐β‑半乳糖苷酶GalNC2‑13及其制备方法和应用，该β‑半乳糖苷酶GalNC2‑13氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，共592个氨基酸，理论分子量为67.83kDa，编码基因如SEQ ID NO.2所示。所述β‑半乳糖苷酶GalNC2‑13具有较好的NaCl稳定性，在食品工业、合成低聚半乳糖(GOS)及作为报告基因等具有较好的应用潜力。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种耐盐β-半乳糖苷酶GalNC2-13及其制备方法和应用。

背景技术

β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)能够催化乳糖水解生成半乳糖和葡萄糖；其次该酶具有将乳糖催化形成低聚半乳糖的转糖基活性。乳糖是一种二糖，在哺乳动物的乳汁中含量丰富，对新生儿的营养至关重要；可被肠道中的乳糖酶水解成可吸收的葡萄糖和半乳糖。耐盐β-半乳糖苷酶在高盐浓度中具有较高的酶活，在高盐工艺的食品工业中消化植物多糖。此外，还可合成低聚半乳糖(GOS)及作为报告基因。GOS由β-半乳糖苷酶通过乳糖水解过程中的转糖基化活性产生的，为食品中不可消化的益生元的成分，对人体健康至关重要，且酶法制备GOS具有简单、高效、量大、副反应较少等优势。

目前主要采取β-半乳糖苷酶水解乳糖的方法制备GOS。GOS具有促进益生菌增殖预防和治疗便秘等功能；其次，在食品工业中用作发酵乳产品、面包和饮料等低热量甜味剂；在婴幼儿配方奶粉、烘焙食品和宠物食品等诸多领域有着广泛的应用。此外，可解决乳糖不耐的问题。此外，在酸性条件下可于室温下长时间保存并应用于各种产品而不会分解，故其在乳清和牛奶加工市场应用前景非常广阔。因此开发多功能的β-半乳糖苷酶具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种耐盐β-半乳糖苷酶GalNC2-13及其制备方法和应用，同时还提供了该水解酶的构建方法，本发明耐盐β-半乳糖苷酶GalNC2-13不仅具有良好的耐盐特性，还具有高效转糖基活性和高效水解乳糖活性。

为了实现上述技术目的，本发明具体采用以下技术方案：

一种耐盐β-半乳糖苷酶GalNC2-13，所述β-半乳糖苷酶GalNC2-13来源于动物粪便微生物宏基因组，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，共592个氨基酸，理论分子量为67.83kDa。

所述β-半乳糖苷酶GalNC2-13最适作用pH为6.5，在pH 6.0、pH 6.5下处理1h，其剩余酶活分别为130％、132％；最适作用温度为37℃，在37℃条件下耐受0.5h达到半衰期；该酶具有较好的NaCl稳定性，在NaCl浓度为0.5mol/L时酶活性达到最大(约2倍)。在0.5-1.0mol/LNaCl浓度下可达200％以上；1.5mol/L NaCl浓度下维持190％活性；在2.0-2.5mol/L浓度下均保持在130％以上；即使在3.0-5.0mol/LNaCl下也能维持在65％-95％。

在本发明的另一方面，提供了所述耐盐β-半乳糖苷酶GalNC2-13的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，基因大小为1779bp。

在本发明的另一方面，提供了包含所述耐盐β-半乳糖苷酶GalNC2-13编码基因的重组表达载体，所述重组表达载体为pEASY-E2/GalNC2-13。

在本发明的另一方面，提供了包含所述耐盐β-半乳糖苷酶GalNC2-13编码基因的重组菌株，所述菌株包括但不限于大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌，优选为重组菌株BL21(DE3)/GalNC2-13。

本发明通过PCR的方法克隆到β-半乳糖苷酶编码基因，将β-半乳糖苷酶编码基因GalNC2-13与质粒pEASY-E2连接得到重组表达载体，然后转化大肠杆菌BL21(DE3)获得重组菌。

在本发明的另一方面，提供了所述耐盐β-半乳糖苷酶GalNC2-13的制备方法，包括以下步骤：