[发明专利]一种提高乳酰-N-四糖产量的基因工程菌及其生产方法

说明书

本发明公开了一种提高乳酰‑N‑四糖产量的基因工程菌及其生产方法，属于代谢工程和食品发酵技术领域。本发明通过lgtA和wbgO的外源表达，组合调控乳酰‑N‑四糖合成途径中galE，galT和galK的表达并敲除大肠杆菌宿主乳酰‑N‑四糖合成途径中的lacZ表达，以及对发酵培养基的半乳糖和IPTG添加量进行优化，从而达到提高乳酰‑N‑四糖产量的目的，在摇瓶实验中，大肠杆菌生产乳酰‑N‑四糖的能力由0.22g/L提升至4.00g/L，在3L发酵罐中，乳酰‑N‑四糖的产量达到19.80g/L，为乳酰‑N‑四糖的工业化生产奠定了基础。

技术领域

本发明涉及一种提高乳酰-N-四糖产量的基因工程菌及其生产方法，属于代谢工程和食品发酵技术领域。

背景技术

人乳寡糖（human milk oligosaccharides，HMOs）是存在于人乳中的一类天然存在的低聚糖，对婴儿消化系统的早期发育，及出生后免疫系统的完善和体内生态平衡的建立发挥着不可替代的作用。HMOs可耐受婴儿消化道内酶的水解，进而抵御胃肠道病原微生物的感染和维持胃肠道微生态平衡。乳酰-N-四糖（LNT）是人乳寡糖中的一种重要寡糖，能够增强人体免疫力，调节肠道菌群，促进细胞成熟和加速伤口愈合等生物学功能。鉴于乳酰-N-四糖的重要生物功能和生理活性，已经允许添加进商品化婴幼儿配方奶粉中。虽然近年来对人乳寡糖各组分的研究不断深入，但其具体的生物功能还不是很明确，因此获得足够量结构均一的人乳寡糖单体来开展它们的生物学功能研究，以及开发其在医药领域的应用是现阶段研究人员迫切需要解决的问题。

目前报道的乳酰-N-四糖的合成方法主要包括三种，分别是化学合成、酶法合成和发酵法合成。化学合成法存在反应步骤复杂、原材料价格昂贵等问题，造成生产成本较高不利于工业的大规模合成，且化学合成中使用的部分有毒试剂，使产品不宜用于食品添加剂。酶合成法需要昂贵的核苷酸糖作为底物，不利于乳酰-N-四糖的大规模生产。而生物法可以利用廉价碳氮源和底物，实现乳酰N-四糖的合成，且对环境不造成影响。因此，通过生物法制备乳酰-N-四糖受到了越来越多的关注。

最近，Florian等人利用半乳糖作为碳源在大肠杆菌细胞内发酵合成LNT，产量达到12.72 g/L（Florian等人，2015），但是该方法使用的半乳糖作为唯一碳源，导致生产成本升高，且最终产量不高，因此，寻求廉价高产的LNT合成方法来解决目前微生物生产的瓶颈，打造更高效的生产菌株是非常必要的。

发明内容

[技术问题]

现有技术不能提供成本低廉且绿色高效生产乳酰-N-四糖的方法。

[技术方案]

本发明为了解决现有微生物方法合成的乳酰-N-四糖产量较低的问题，提供了一种产乳酰-N-四糖的基因工程菌及其构建方法。

本发明的第一个目的是提供一种基因工程菌，所述基因工程菌敲除了β-半乳糖苷酶基因 lacZ，并过表达β-1,3-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶基因 lgtA和β-1,3-半乳糖基转移酶基因 wbgO。