[发明专利]用于检测ALDH2基因的方法、试剂盒、引物对、探针、基因芯片及应用

说明书

本发明公开了一种用于检测ALDH2基因的方法、试剂盒、引物对、探针、基因芯片及应用。所述试剂盒包括PCR反应体系和基因芯片，所述PCR反应体系包括由一上游引物和一下游引物组成的引物对，所述引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；和/或，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3和/或SEQ ID NO.4所示。本发明的方法、试剂盒、引物对及探针用于检测ALDH2基因时，操作简单、成本低廉，具有较高灵敏度、结果易读精准。

技术领域

本发明涉及体外诊断试剂领域，尤其涉及一种用于检测ALDH2基因的方法、试剂盒、引物对、探针、基因芯片及应用。

背景技术

血液作为一种重要的生物样本，其内含有大量的DNA聚合酶抑制物质，如血红素、杂蛋白、脂肪等。为了完成血液样本核酸的PCR扩增，必须先从血液中对核酸物质进行纯化处理。一般包括以下三个过程，一是破裂细胞膜和核膜；二是纯化核酸，即去除蛋白质等影响后续PCR反应的杂质；三是洗脱核酸。通过提取处理虽然可以获得纯度比较高的核酸，但是核酸提取过程往往会导致大量的核酸损失，同时繁琐的提取纯化步骤增加了样本间交叉污染的风险，从而增加了后续PCR扩增失败的可能。此外由于提取过程耗时长，成本高，有些提取方法还需借助苯酚等有害试剂，增加了操作人员感染的风险，且难以实现高通量检测。因此，血液样本能够直接作为模板或经过简单处理就能够作为模板进行PCR扩增检测，成为血液样本扩增需要解决的难题。

人类乙醛脱氢酶(acetaldehyde dehydrogenase，ALDH)，是一种四联体蛋白，催化乙醛及其他脂肪族醛氧化。目前人们已经发现19种ALDH基因，主要有4种：ALDH1、ALDH2、ALDH3和ALDH4，由位于四个不同染色体的独立基因位点编码。其中，ALDH2是乙醛脱氢酶家族19个成员中活性最强的一员，ALDH2在体内将酒精的中间代谢产物乙醛氧化为乙酸的能力最强，与60％以上的乙醛代谢有关。ALDH2位于线粒体内，其基因位于第12号染色体的12q24.2位置，全长43,438bp，共有13个外显子，编码由517个氨基酸残基组成的多肽。

ALDH2基因有不同的基因型分布在人群中，该基因最常见的单核苷酸多态性(rs671)由编码ALDH2基因的第12号外显子504位的谷氨酸残基突变为赖氨酸(Glu504Lys)所致。这一多态性使ALDH2出现三种不同的基因型：ALDH2*1/*1(野生纯合子)，ALDH2*1/*2(杂合子型)，ALDH2*2/*2(突变纯合子)。携带不同的基因型会出现不同的ALDH2酶活性：野生纯合子酶活性正常，杂合子酶活性下降30％～50％，突变纯合子酶活性基本消失。

目前，关于ALDH2基因分型的检测多采用荧光定量PCR，高分辨溶解曲线、基因测序等技术手段。基因测序的方法适合高通量多位点的检测，但操作耗时长且灵敏度低，不适合快速临床检测；并且测序获得结果信息量较大，很多信息对患者没有用处，测序结果判读也需要一些专业知识，费用也相对高。高分辨率溶解曲线法对设备要求比较特殊，需要具有安装高分辨率软件、温度比较敏感的机器才能使用，临床推广存在一定的困难。

关于荧光定量PCR法，CN201811034949公开了一种人类ALDH2基因多态性检测试剂盒，包括用于扩增ALDH2基因G1510A位点的PCR预混反应液、阳性对照品及阴性对照品组成；携带不同荧光的带有标签序列的ARMs引物可特异性识别并扩增野生和突变基因型的模板，并且随着引物的消耗，将更多的荧光释放出来，在循环结束时，采集各通道荧光，生成荧光曲线。使用这些方法进行ALDH2基因分型检测均不同程度存在购买仪器成本高，需抽提基因组DNA、操作程序复杂等问题，不利于提高检测效率并实现临床推广普及。从目前来看，这种检测需求又非常巨大，因此寻找一种高效且价格容易被患者接受的检测手段，对于ALDH2基因分型检测有着重要的现实意义。