[发明专利]一种普卡那肽的制备方法

说明书

本发明公开了一种普卡那肽的固相片段合成方法，属于多肽合成技术领域，所述方法使用固相合成法逐个连接4‑16片段，然后将1‑3片段连接到4‑16片段固相树脂上得到全肽树脂，酸解同步进行脱侧链保护基及切肽，得到普卡那肽粗品，经纯化、冻干得到普卡那肽纯品。本发明采用了保护氨基酸片段Fmoc‑Asn(Trt)‑Asp(OtBu)‑Glu(OtBu)‑OH为原料，减少了杂质的产生，缩短了合成周期，所得粗品纯度高，易于纯化，具有较好的应用前景。

技术领域：本发明涉及多肽药物制备领域，尤其是涉及一种固相法制备普卡那肽的方法

背景技术：普卡那肽(Plecanatide)是尿鸟苷蛋白(uroguanylin，UGN)的类似物,具有促尿钠排泄的鸟苷酸环化酶受体激动药的作用,能调节胃肠道中的酸碱离子,诱导液体转运进入胃肠道,增加胃肠道的蠕动，用于治疗成人慢性特发性便秘(chronicidiopathic constipation,CIC)、便秘型肠易激综合征(constipation-predominantirritable bowel syndrome,IBS-C)。

普卡那肽是一种比较难制备的16肽，序列中含有双二硫键且具有独特的空间缠绕结构，固相连接过程中极易发生缩聚，导致合成困难。专利CN105764916A报道了固液相结合的方法合成普卡那肽，首先固相合成1-6片段1，固相合成7-14片段2，液相合成15-16片段3，然后按顺序在液相中连接片段2,3，再连接片段1，得到普卡那肽线性肽。该方法工艺繁琐，中间体多，操作复杂，生产成本高。专利CN104628827B报道了逐步法合成普卡那肽的方法，其中Cys采用了StBu,Mmt,Acm保护，且在固相树脂上进行氧化。该方法Cys保护基的脱除难度较大。且在树脂上氧化，反应中控难度较大，无法保证氧化完全。专利CN108864254A报道了固相合成肽树脂，4,12位Cys用StBu保护；7,15位氨基酸用3-Cl-Ala代替Cys氨基酸。该方法在3-Cl-Ala转化成Cys的步骤中，存在转化不完全的风险，不利于大规模生产。专利CN107383170A报道了固相合成普卡那肽的方法，采用空气自然氧化的方法构建两对二硫键。由于普卡那肽有两对二硫键，自然氧化可参产生两种错搭肽，拓扑异构以及多聚体，不利于大规模生产。专利CN1080003222A报道了固相合成普卡那肽的方法，首先液相逐步合成全保护1-6片段，再固相合成7-16片段，再用酶促法将6肽片段连接到肽树脂上。该法逐步法合成1-6难度太大，不适用于工业化生产。

普卡那肽是一款市场需求量达到百公斤级别的多肽口服原料药，上述专利虽然具有一定技术上的新颖性，但是规模化生产，难度较大。在普卡那肽的研究中，我们发现普卡那肽序列的特殊性，导致其易发生缩聚现象，属于“困难肽”，常规方法连接时会发生偶联困难，因此需要加入具有大位阻保护基的氨基酸，改变其二级结构，缓解缩聚现象。此外，在固相连接最后三个氨基酸时发现，容易产生β-Asp,Assu，D-Asp，D-Asn，以及缺失肽等杂质，而分析原研制剂发现，这些杂质控制在极低水平，需要采取适当方法解决上述杂质含量较高的问题。

发明内容：

为解决上述问题，开发一种易于合成、杂质含量少的普卡那肽制备方法十分必要。为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：

一种普卡那肽的制备方法，包括：

步骤1)将Fmoc-Leu-OH连接至固相树脂上。

步骤2)按照序列利用固相合成法逐个连接4-16片段，得到H-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-Cys(Acm)-Val-Asn(Trt)-Val-Ala-Cys(Trt)-Thr(tBu)-(Hmb)Gly-Cys(Acm)-Leu-Wang树脂。