[发明专利]一种高分辨质谱筛选牦牛胶原蛋白特征片段的方法

权利要求书

1.一种高分辨质谱筛选牦牛胶原蛋白特征片段的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)样本采集

收集耗牛副产物作为样本，之后将其分割成小块，于低温保存，备用；

(2)预处理

将牦牛副产物进行脱脂和除杂处理，之后用纯水清洗干净，备用；

(3)酶解

将预处理后的耗牛副产物放置于80～90℃热水中保温预变性处理2～4h，之后冷却至45～50℃，调节pH 8～9，加入碱性蛋白酶与丝氨酸蛋白酶的复合酶液酶解4～6h，高温灭酶活后获得酶解液；

(4)高效液相色谱分离

将酶解液采用纳升流速的高效液相色谱系统EasynLC进行分离；

(5)质谱鉴定

酶解液经色谱分离后用Q-Exactive质谱仪进行质谱鉴定；

(6)特征片段筛选

质谱鉴定结果的原始文件用Mascot2.2软件检索UniProt蛋白数据库，筛选得到耗牛胶原蛋白的特征片段。

2.如权利要求1所述的一种高分辨质谱筛选牦牛胶原蛋白特征片段的方法，其特征在于所述步骤(4)高效液相色谱分离的参数为，流动相A液为0.1％甲酸水溶液，流动相B液为0.1％甲酸乙腈水溶液，乙腈为84％；色谱柱以95％的A液平衡，样品由自动进样器上样到上样柱，经过分析柱分离，流速为300nL/min。

3.如权利要求1所述的一种高分辨质谱筛选牦牛胶原蛋白特征片段的方法，其特征在于所述步骤(4)高效液相色谱分离的参数中，择液相梯度为0.5小时液相梯度：0.00～20.00min，B液线性梯度从5％到35％；20.00～22.00min，B液线性梯度从35％到100％；22.00～30.00min，B液维持在100％。

4.如权利要求2所述的一种高分辨质谱筛选牦牛胶原蛋白特征片段的方法，其特征在于，上样柱为Thermo Scientific Acclaim PepMap100,100μm*2cm,nanoViper C18。

5.如权利要求2所述的一种高分辨质谱筛选牦牛胶原蛋白特征片段的方法，其特征在于，分析柱为Thermo scientific EASY column,10cm,ID75μm,3μm,C18-A2。

6.如权利要求1所述的一种高分辨质谱筛选牦牛胶原蛋白特征片段的方法，其特征在于所述步骤(5)质谱鉴定的参数为，分析时长为60min或120min或240min，检测方式为正离子，母离子扫描范围300～1800m/z，一级质谱分辨率为70000at 200m/z，AGC target为3e6，一级Maximum IT为10ms，Number of scan ranges为1，Dynamic exclusion为40.0s；多肽和多肽碎片的质量电荷比按照下列方法采集：每次全扫描后采集20个碎片图谱，MS2Activation Type为HCD，Isolation window为2m/z，二级质谱分辨率17500at 200m/z，Microscans为1，二级Maximum IT为60ms，Normalized Collision Energy为30eV，Underfill为0.1％。

7.如权利要求1所述的一种高分辨质谱筛选牦牛胶原蛋白特征片段的方法，其特征在于所述步骤(6)特征片段筛选具体为，质谱测试原始文件用Mascot2.2软件检索UniProt蛋白数据库，搜库的物种信息为牦牛，蛋白质组学工具3.1.6，并按得分≥20筛选序列；在搜库得到的一系列序列中，筛选出高丰度以及源于牦牛Ⅰ型牛胶原蛋白的肽段，最后将这些肽段在NCBI网站上进行blast分析，排除自身存在而未检测到的肽段或其他可能物种的肽段干扰，进一步确认其特异性，筛选出牦牛胶原蛋白特征片段。

8.如权利要求1所述的一种高分辨质谱筛选牦牛胶原蛋白特征片段的方法，其特征在于，筛选出牦牛胶原蛋白特征片段为GADGAPGKDGVR、GEGGPQGPR、GEKGETGLR、EGLRGPR。