[发明专利]一种可以在毕赤酵母高效分泌的单加氧酶突变体及应用

说明书

本发明涉及一种可以在毕赤酵母高效分泌的单加氧酶突变体及应用，该单加氧酶突变体是将如SEQ ID No.1所示氨基酸序列自N端第1位至X位氨基酸残基替换为SEQ ID No.2所示氨基酸序列第1位至X位氨基酸残基所形成的蛋白质，其中X为125‑135的整数；并在所形成如SEQ ID No.3的氨基酸序列的基础上，对一个或多个氨基酸残基发生突变得到多个性能更佳的单加氧酶突变体。本发明的单加氧酶突变体能在毕赤酵母中高效分泌表达，可直接使用发酵上清液作为酶促反应的催化剂，与大肠杆菌胞内重组表达的单加氧酶相比，本发明的单加氧酶获取简单，蛋白纯度高，避免了常规制备胞内酶的细胞破碎过程，并简化了下游分离提取过程，具有良好的工业应用前景。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种单加氧酶突变体及其基因，含有该基因的重组表达质粒和重组表达转化体，所述单加氧酶突变体的制备，以及所述单加氧酶突变体在(S)-奥美拉唑合成中的应用。

背景技术

手性亚砜如(S)-5-甲氧基-2-[[(4-甲氧基-3,5-二甲基-2-吡啶基)甲基]亚磺酰基]-1H-苯并咪唑((S)-奥美拉唑，也称埃索美拉唑)是治疗胃食管反流性疾病的质子泵抑制剂。临床研究表明，只有(S)-构型的亚砜具备治疗效力，因而这类拉唑类药物的光学纯度对药物的药效有极其重要的影响。潜手性硫醚的不对称氧化是合成该类手性亚砜的重要制备方法。目前工业上制备亚砜常采用金属不对称氧化法(WO9118895；JP9971370)，但是也存在较多问题。例如，催化过程中用到大量的金属催化剂，过氧酸和有机溶剂对操作人员和环境影响较大；后处理工艺中用到萃取、干燥、过滤、浓缩等操作，操作较为繁琐；后处理过程中产生较多的三废；且化学催化剂常催化亚砜过度氧化为砜，而副产物砜的分离和去除是非常困难的。

生物催化硫醚的不对称氧化具备反应条件温和、化学及立体选择性高，仅产生副产物水等优点，近些年来成为新兴的手性亚砜绿色合成途径。在现有的生物催化不对称氧化硫醚产生亚砜的工具酶中，Baeyer-Villger单加氧酶(BVMO)是催化亚砜合成研究较多的一类酶，拥有高度的选择性和广泛的底物谱，在合成高附加值化学品、手性砌块以及大宗化学品等方面具有潜在的应用价值(ACS Catal.2019,9,11207-11241)。尽管天然BVMO对部分小位阻硫醚具备一定的活力和较优的立体选择性，但对于潜手性大位阻拉唑硫醚如奥美拉唑硫醚则没有活力或仅产生无效构型的产物(Appl.Microbiol.Biotechnol.2021,105,3169–3180)。

本申请发明人通过基因挖掘的方法获得了来源于醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)的环己酮单加氧酶(AcCHMO)，随后采用基于结构的理性设计和定向进化改造等多种策略，获得突变体AcCHMO_V6，实现了该酶底物偏好性由环己酮向奥美拉唑硫醚的偏转(ACS Sustainable Chem.Eng.2019,7,7218-7226；Biotechnol.Bioeng.2020,118,1–8；Mol.Catal.2021,509,111625)，并实现了反应的中试过程放大(Org.Process Res.Dev.2020,24,1124-1130)。

尽管生物催化奥美拉唑硫醚不对称氧化已经取得了一定的进展，但目前已有的BVMO整细胞催化奥美拉唑硫醚氧化活力相对较低，在催化过程中通常需要将大肠杆菌胞内表达的单加氧酶纯化制备为纯酶以求提高添加量，操作繁琐；或需要将细胞破碎制备为粗酶液，由于粗酶液含有较多胞内杂质如核酸等，反应后处理萃取过程存在严重的乳化。另一方面，由于大肠杆菌本身为条件致病菌，其细胞膜含有内毒素，限制了其在目标反应产物为食药相关分子生产中的应用。作为发展成熟的食药安全宿主，毕赤酵母(Pichia pastoris)具有生长周期短，易于大规模高密度发酵、对蛋白具备简单的翻译后修饰和成熟的跨膜分泌系统等优势。目前，尚无任何利用毕赤酵母分泌表达BVMO的报道。

发明内容