[发明专利]一种细菌蛋白酶及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种细菌蛋白酶E423的应用，其特征在于，将所述的细菌蛋白酶E423与胶原蛋白、复合多糖一起反应，制备胶原蛋白-复合多糖复合海绵；

胶原蛋白-复合多糖复合海绵的制备包括以下步骤：

(1)复合多糖原液的配制：蒸馏水配制1.5-2.5％的复合多糖原液；

(2)胶原蛋白原液获得：酸提取猪胶原蛋白得到的胶原液，浓度为20-40g/L；

(3)胶原蛋白-复合多糖复合海绵的制备：取胶原蛋白原液∶复合多糖原液∶10-15％戊二醛溶液＝3-5∶1∶1，然后加入5％-15％发酵制备的蛋白酶E423酶液，反应总体系中酶活力范围100-200U/ml，混合均匀后倒入模具，经过脱泡、固定成模、预冷、冷冻干燥获得改性胶原蛋白-多糖复合海绵；

所述的细菌蛋白酶为保藏编号CCTCCNo.M2015024的假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)CSN423-M所产的胞外蛋白酶E423；其制备方法如下：

先采用人工海水代替蒸馏水配制的培养基进行斜面培养和种子培养，最后采用发酵罐培养；

(1)斜面培养

采用划线法将CSN423-M接种到2216E固体斜面培养基上，16～22℃培养24-48h得到复壮菌体；2216E固体斜面培养基：蛋白胨5g，酵母粉1g，Fe₂(PO₄)₃0.01g，加人工海水至1000ml，pH 8.0，琼脂粉15g，高压蒸汽灭菌；

(2)种子培养

将步骤(1)中的复壮菌体接种到人工海水LB液体种子培养基中，16～22℃，160-200rpm培养16-20h，得到发酵种子；

人工海水LB液体种子培养基：蛋白胨1％、酵母粉0.5％、NaCl 1％，人工海水补足，NaOH调pH为8.0；

将发酵种子按发酵培养基体积的4-10％接入发酵罐中，发酵罐参数：罐温15-25℃、罐压0.03-0.05MPa，搅拌速率380-420rpm，通气比为1：1.0-1：1.5，发酵时间为72-96h；

发酵培养基按质量百分数计包含以下组分组成：玉米粉1.40-1.45％、豆粉3.60-3.65％、酪素1.8-2.1％、CaCl₂ 0.13-0.18％、K₂HPO₄0.2-0.4％、KH₂PO₄0.08-0.14％，水补足，NaOH调pH为7.5-8.0；

所述细菌蛋白酶E423序列如SEQ ID NO.1所示。