[发明专利]一种负载膜结合型肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体和小分子抗肿瘤药物的复合外泌体

说明书

本发明涉及生物医药与肿瘤学技术领域，具体是一种负载膜结合型肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体和小分子抗肿瘤药物的复合外泌体及其制备方法和应用。所述的复合外泌体的膜表面携带TRAIL蛋白，膜内包载小分子抗肿瘤药物。本发明的复合外泌体制备工艺成熟、高效、重现性好、成本低；复合外泌体的体外和体内抗肿瘤效果显著，药物用量低且无毒副作用，生物安全性良好，为肿瘤临床治疗提供了新的策略。

技术领域

本发明涉及生物医药与肿瘤学技术领域，具体地说，是一种负载膜结合型肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体和小分子抗肿瘤药物的复合外泌体及其制备方法和应用。

背景技术

皮肤恶性黑色素瘤是一种由皮肤和其他器官的黑色素细胞产生的恶性肿瘤，约占全部肿瘤3％，具有较强的侵袭性和转移性；发病率高，预后差，晚期黑色素瘤死亡率高达70～90％，居皮肤恶性肿瘤首位。根据2021年美国癌症协会的统计数据，2020年全球皮肤原位黑色素瘤新增诊断病例106110例，死亡病例7180例，并以每年3～5％的速度增长，成为全球增速最快的恶性肿瘤之一，晚期黑色素瘤五年生存率仅为25％。目前恶性黑色素瘤的治疗方法主要有化疗、放疗、手术切除、免疫疗法和靶向治疗等。化疗仍是目前治疗黑色素瘤的主要方法，主要化疗药物包括达卡巴嗪、替莫唑胺、卡铂、紫杉醇、福莫司汀和顺铂等，但在黑色素瘤中的单药或联合用药有效率均不高，约10～15％，而且损伤人体正常免疫功能和产生严重的毒副作用。因此，亟需新型、有效且安全的黑色素瘤治疗方法。

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(Tumor necrosis factor related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)属于肿瘤坏死因子超家族成员，对多种人源肿瘤细胞有促凋亡效果，包括黑色素瘤、肺癌、神经胶质瘤、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、结肠癌、肾癌和胆管癌。

死亡受体5(Death receptor 5，DR5)是TRAIL的主要作用受体，在多种肿瘤细胞表面高表达，而在正常细胞中低表达或不表达。DR5含有死亡结构域(Death domain，DD)，与TRAIL结合后，通过DD与Fas相关死亡功能域蛋白(Fas-associated death domainprotein，FADD)结合，募集pro-caspase 8，生成死亡诱导信号复合体(Death inducingsignaling complex，DISC)，DISC中的pro-caspase 8自我剪切成具有活性的caspase 8，通过caspase级联反应和线粒体依赖途径激活caspase 3，从而介导细胞凋亡。

目前基于TRAIL的疗法包括重组人可溶性TRAIL(Recombinant human TRAIL，rhTRAIL)，并已经用于多种人源肿瘤的临床前研究和临床试验中。但rhTRAIL的肿瘤靶向性差，体内半衰期短，易引起细胞耐药性，导致疗效较差。因此，鉴于rhTRAIL的不足，需要开发有效安全的TRAIL递送形式，以规避TRAIL抗性和提高疗效。

巨噬细胞作为天然的免疫细胞和抗原呈递细胞，在调节肿瘤免疫微环境中发挥重要作用。M1型巨噬细胞，如Raw264.7，可与肿瘤组织特异性结合，因此，被广泛用于肿瘤靶向治疗。M1型巨噬细胞肿瘤靶向能力来自其表面膜蛋白，同时其产生的外泌体具有与巨噬细胞相似的表面膜特性，并保留细胞的靶向能力和肿瘤渗透能力。此外，外泌体可以作为一种天然的内源性纳米载体，也具有其他独特优势，如稳定性高、毒性小、免疫原性低、生物相容性好；肿瘤渗透性强，可透过血脑屏障；可递送多种治疗药物，如膜蛋白、miRNA、siRNA和小分子化学药物。研究发现，膜结合型TRAIL可以增加其稳定性和提高生物利用度和靶向性，并表现出比rhTRAIL更强的促凋亡活性，这可能由于膜结合型TRAIL超分子结构中形成寡聚促进了DR5的受体聚簇，增强了凋亡诱导效率和信号的传导。