[发明专利]一种HSV减毒株及其制备方法与应用

权利要求书

1.一种HSV减毒株，保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.21598，保藏日期为2021年07月13日。

2.根据权利要求1所述的HSV减毒株的制备方法，其特征在于，对HSV1进行修饰重编，具体包括：剪切去除HSV1病毒的Us5基因第185到329位核苷酸的片段；剪切去除UL41基因从249到435位编码区的基因；剪切去除Us11基因从91到289位编码区的基因；剪切去除RL1基因序列中编码从207到453位核苷酸序列的基因片段。

3.根据权利要求2所述的HSV减毒株的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）设计引物A，在Cas9酶存在下，剪切HSV病毒的Us5基因编码区第185到329位核苷酸的基因片段，并经过克隆纯化筛选，得到Us5基因部分剪切病毒株，命名为WR-1；

（2）在WR-1的基础上，设计引物B，在Cas9酶存在下，剪切UL41基因从249到435位编码区核苷酸的基因片段，得到UL41基因部分删除的毒株，命名为WR-2；

（3）在WR-2的基础上，设计引物C，在Cas9酶存在下，剪切Us11编码区从91到289位的核苷酸基因片段，并经过克隆纯化筛选，产生WR-3毒株；

（4）在WR-3的基础上，设计引物D，在Cas9酶存在下，去除RL1基因序列中编码从207到453位核苷酸序列的基因片段，并经过克隆纯化筛选，获得HSV1减毒株。

4.根据权利要求3所述的HSV1减毒株的其制备方法，其特征在于：

引物A的核苷酸序列表为：US5-F1:CACC GGGCTTTTGGGAAGCCTCGT；US5-R1:AAACACGAGGCTTC CCAAAAGCCC；US5-F2:CACC GGGCTGTGCGCCGTAGTCCT；US5-R2:AAAC AGGACTACGGCGCACAGCCC；

剪切后的Us5基因序列如SEQ ID NO:1所示

引物B的核苷酸序列表为UL41-F1:CACC CATCTTCGTTACCGATCGCG；UL41-R1:AAACCGCGATCGGT AACGAAGATG；UL41-F2:CACC CGCGGCACCTCTCTGG CCTC；UL41-R2:AAACGAGGCCAGAG AGGTGCCGCG；

剪切后的UL41基因序列如SEQ ID NO:2所示；

引物C的核苷酸序列表为US11-F1:CACC TCCGCCG GCATGCACCC CAG；US11-R1:AAACCTGGGGTGCA TGCCGGCGGA；US11-F2:CACC GCGAGCTCCC AGAGACCCCA；US11-R2:AAACTGGGGTCTCT GGGAGCTCGC；

剪切后的Us11基因序列如SEQ ID NO:3所示；

引物D的核苷酸序列表为RL1-F1:CACC GAGTCCGCGT CCGACGACGA；RL1-R1:AAACTCGTCGTCGG ACGCGGACTC；RL1-F2:CACC CGCCTGCG CCTGCGACGC GC；RL1-R2:AAACGCGCGTCGCA GGCGCAGGCG；

剪切后的RL1基因序列如SEQ ID NO:4所示。

5.根据权利要求3或4所述的HSV减毒株的其制备方法，其特征在于：步骤（1）-（4）中，克隆纯化筛选方法为：

Vero细胞铺种于6孔板中至细胞贴壁完全后，弃去原有培养基，用PBS清洗，突变病毒用无血清MEM培养基以1:1-1:10⁶稀释后取不同稀释度的病毒液以1ml/每孔的体积加入各个细胞孔中，并设置1个阴性对照孔；

置于5%CO₂ 37℃培养箱中吸附2-3h；

随后，弃去细胞培养板中的病毒液后缓慢沿板壁按2.5-3ml/孔的体积将已高压并使其温度降至42℃左右的琼脂糖培养基混合物加入细胞孔中；

待其冷后置于5%CO₂37℃倒置培养，观察3-4天直到蚀斑出现；至出现肉眼可见蚀斑后，标记后挑取蚀斑并重悬于100ul无血清DMEM培养基。