[发明专利]引物对及其应用和试剂盒、样本检测系统及检测方法

说明书

本发明涉及宫颈癌检测技术领域，具体公开一种引物对及其应用和试剂盒、样本检测系统及检测方法。所述引物对包括引物对1、引物对2、引物对3和引物对4；所述引物对1包括上游引物1和下游引物1，编码核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～2所示；所述引物对2包括上游引物2和下游引物2，编码核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3～4所示；所述引物对3包括上游引物3和下游引物3，编码核苷酸序列分别如SEQ ID NO.5～6所示；所述引物对4包括上游引物4和下游引物4，编码核苷酸序列分别如SEQ IDNO.7～8所示。本发明的引物对对人乳头瘤病毒具有高特异性和高敏感性，可提高人乳头瘤病毒检测的准确性。

【技术领域】

本发明涉及宫颈癌检测技术领域，尤其涉及一种引物对及其应用和试剂盒、样本检测系统及检测方法。

【背景技术】

人乳头瘤病毒(英文全称：human papilloma virus；简称：HPV)是一种属于乳多空病毒科的乳头瘤空泡病毒A属，是球形DNA病毒，能引起人体皮肤黏膜的鳞状上皮增殖。具体表现为寻常疣、生殖器疣(尖锐湿疣)等症状；随着性病中尖锐湿疣的发病率急速上升和宫颈癌、肛门癌等的增多，HPV感染越来越引起人们的关注。目前发现的HPV基因型已经超过200种，其中只有14种可以诱发宫颈癌，即HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68。此外，即使是这14种高危型HPV中也并不是每一种基因型都具有相同的致癌能力。HPV16和18是其中危害最大的两个基因型，二者分别导致55％和15％的宫颈癌病例。根据侵犯的组织部位不同和致病性可划分为四种类型：皮肤低危型、皮肤高危型、黏膜低危型和黏膜高危型，高危型与宫颈癌的发病有关，低危型与生殖道疣状物有关。为避免感染以及感染时获得及时的治疗，需要对人是否感染HPV以及感染的HPV类型进行检测，但是，由于HPV分型检测的特殊性，目前的检测方法至少存在以下缺陷：

(1)、难以找到合适的、具有特异性的引物。由于引物的通用性与引物的特异性，检测的通用性与检测的敏感性，是一对相互对立的矛盾。既要覆盖尽可能多的型别，又要检测精准，是引物设计与扩增条件设置的难点，这也是导致现有检测覆盖率低的主要原因。

(2)、温度影响检测结果的准确性，导致不容易判断。有研究者通过测试显示，引物结合温度变动0.5℃，也对分型的检测结果具有较大影响。如Micalessi等对31个HPV质粒进行SPF10实时定量PC扩增测试，显示这些质粒具各自Tm值，范围在79.7℃～83.4℃。对用SPF10常规PCR条件(10μL/49℃)扩增鉴定出HPV型别的4例标本(两个16型和两个31型)，随后设定49.0℃、49.5℃、50.0℃共3个温度梯度，并用1μL和10μL两个待测样品量再用实时定量PCR测试。结果显示，有一个HPV16型阳性的样品3次未检出，3次检出；一个HPV31型阳性的样品4次检出有44型的波峰。对1:1～1000比例混合的HPV16和HPV31全序列质粒进行实时定量PCR扩增测试显示，如若获得正确的分型结果，扩增的Cp(crossing point)为19.5～33.56，Tm(melting temperature)为80.7℃～81.5℃，Cp和Tm均不相同。

(3)、容易出现假阳性或者假阴性。由于HPV基因变异的存在，试图在HPV基因组序列内找到完全一致的序列，设计出型别全覆盖的引物是不可能实现的，所以难以避免检测时出现假阴性。提高引物的通用性是以牺牲引物的特异性和型特异最适反应条件为代价的，这势必降低了检测的敏感性和准确性，从而造成漏检、错检。

基于上述缺陷，有必要提供一种新的技术方案以解决现有HPV检测存在的上述技术问题。

【发明内容】

本发明的目的之一在于提供一种引物对，以解决现有人乳头瘤病毒检测的引物对特异性差、易出现假阴性或假阳性以及检测准确性较低等问题。

为实现上述技术目标，采用如下的技术方案：

引物对，包括引物对1、引物对2、引物对3和引物对4；