[发明专利]一种重组微生物及其制备方法和在苏氨酸生产中的应用

说明书

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种重组微生物及其制备方法和在苏氨酸生产中的应用。所述重组微生物中tpx基因和/或yodD基因的表达被抑制。本发明研究发现抑制菌株中tpx基因或yodD基因可以有效提高菌株生产氨基酸等能力，同时敲除了tpx基因和yodD基因的大肠杆菌，其产苏氨酸的能力可达到27.35g/L，糖酸转化率可达到27.94％，这在苏氨酸生产领域具有重要意义。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种重组微生物及其制备方法和在苏氨酸生产中的应用。

背景技术

L-苏氨酸是人和动物生长所必需的8种氨基酸之一，其广泛应用于饲料、食品添加及药物辅助材料制备等。目前L-苏氨酸主要通过微生物发酵生产，多种细菌可用于L-苏氨酸生产，如大肠杆菌、棒状杆菌属、沙雷氏菌属等的野生型诱导获得的突变株作为生产菌株。具体实例包括抗氨基酸类似物突变株或甲硫氨酸、赖氨酸、异亮氨酸等多种营养缺陷型(日本专利申请公开号224684/83；韩国专利申请公开号8022/87)。然而，传统诱变育种由于随机突变造成菌株生长缓慢及产生较多副产物，不易获得高产菌株。

随着苏氨酸需求量的不断增加，高产苏氨酸菌株的构建和改造尤为重要。2003年韩国CJ株式会社申请的中国专利CN03811059.8中，利用大肠杆菌，通过缺失苏氨酸操纵子序列的第-56至-18位的39bp序列，增强苏氨酸合成关键基因thrABC表达，苏氨酸生产力提高22％。Kwang Ho Lee(Kwang Ho Lee等,Systems metabolic engineering ofEscherichia coli for L-threonine production,Mol Syst Biol.2007；3：149)等利用系统代谢工程策略，通过突变编码天冬氨酸激酶I和III的基因thrA、lysC解除产物反馈抑制，通过敲除tdh及弱化ilvA来去除副产物甘氨酸、异亮氨酸，通过失活竞争途径基因metA和lysA为苏氨酸合成提供了更多前体等，最终获得的TH28C(pBRThrABCR3)菌株发酵50h可产酸82.4g/L，糖酸转化率39.3％。

发明内容

为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一种重组微生物及其制备方法和在苏氨酸生产中的应用。

第一方面，本发明提供一种重组微生物，所述重组微生物中tpx基因和/或yodD基因的表达被抑制。

进一步地，所述tpx基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示或与SEQ ID NO.1具有至少60％的序列同一性；和/或，所述yodD基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示或与SEQID NO.3具有至少60％的序列同一性。

SEQ ID NO.1所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；SEQ ID NO.3所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示

进一步地，所述重组微生物的出发菌株为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或沙雷氏菌中的一种或多种。

优选地，所述重组微生物的出发菌株为MHZ-0215-2或MHZ-0217-4。

其中MHZ-0215-2菌株公开于中国专利201611250306.8中，MHZ-0217-4菌株公开于中国专利202011388854.3中。

第二方面，本发明提供所述重组微生物的制备方法，包括：

通过CRISPR-Cas9技术敲除微生物中的tpx基因和/或yodD基因。

本发明进一步提供包括所述重组微生物的微生物制剂。

本发明进一步提供所述重组微生物或所述微生物制剂在生产氨基酸中的应用；优选为在生产苏氨酸中的应用。

本发明进一步提供所述重组微生物或所述微生物制剂在提高苏氨酸产量中的应用。