[发明专利]用于检测犬粪便中冠状病毒的通用引物及试剂盒

说明书

本发明公开了一种用于检测犬粪便中冠状病毒的通用引物及试剂盒。所述引物序列如下：CCoV‑MF:5’‑GCAACAGGATGGGCTTAC‑3’，CCoV‑7aR:5’‑GCATGGAGGAAAACGAGC‑3’。本发明设计的引物可以增加侦测到犬冠状病毒阳性的比例，也可以减少不必要的测序时间的浪费,对于快速筛检有很大的帮助。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及用于检测犬粪便中冠状病毒的通用引物及试剂盒。

背景技术

CCoV(canine coronavirus)属于α冠状病毒，引起犬传染性肠炎，导致犬轻重不一的腹泻，是对犬危害较大的一种病原体。所有年龄的犬都可感染CCoV，但是幼犬更易感染并且发生临床症状。在一个较大范围的调查中，正常犬CCoV的阳性率达45％，腹泻犬阳性率达61％，在对患胃肠炎的宠物犬的粪便检测中，发现19.5％为CCoV阳性。日本腹泻犬曾分离到8个CCoV毒株，试验证明这些毒株在抗原性方面有很大差异，接种SPF犬发现致病性也不相同。目前CCoV已确定了两个基因型，即CCoV-Ⅰ和CCoV-Ⅱ。一般情况下，CCoV会合并感染犬的其他病原体，造成病情加重，然而几年前报道了一种能够造成犬全身性疾病、致死率很高的变异CCoV-Ⅱ强毒株，即泛嗜性犬冠状病毒(CB/05毒株)。

目前检测犬所使用犬冠状病毒的引物并不多,且目前发表文献所使用的引物在使用上有其缺点:1)DNA片段大小小于500bp,2)容易检测出伪阳性以及3)特异性不佳。有鉴于此,开发用于检测犬冠状病毒的通用引物去检测宠物犬或是流浪犬粪便中冠状病毒是当务之急,并且可以做为之后福建龙岩地区犬冠状病毒流行病学调查的依据。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于检测犬粪便中冠状病毒的通用引物及试剂盒，可以快速筛检宠物犬或流浪犬粪便中冠状病毒的存在并提高筛检阳性率与准确度。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

用于检测犬粪便中冠状病毒的通用引物，所述引物序列如下：

CCoV-MF:5’-GCAACAGGATGGGCTTAC-3’

CCoV-7aR:5’-GCATGGAGGAAAACGAGC-3’

采用上述通用引物检测犬粪便中冠状病毒的方法，包括以下步骤：

1)提取病毒RNA，并反转录获得cDNA；

2)以合成的cDNA为模板，以权利要求1中的CCoV-MF和CCoV-7aR为引物，进行PCR扩增反应，预计扩增的目的片段为1290bp，扩增反应总体积为50uL，PCR反应条件如下：95℃预变性5min，95℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸90s，进行30个循环，最后72℃延伸10min，获得PCR产物；

3)将所得PCR产物置于1％琼脂糖凝胶进行电泳，在紫外投射仪上观察并记录实验结果。

检测犬粪便中冠状病毒的试剂盒，所述试剂盒包括上述通用引物。

本发明的技术思路在于：由于利用PCR技术去检测宠物犬或是流浪犬粪便中是否含有冠状病毒存在伪阳性的缺点，因此还需要搭配1)基因组上不同区域DNA片段的引物，2)全基因组测序再次确认有此病原才能真正证实其病原体的存在。

根据美国国家卫生研究院NCBI网站参考犬冠状病毒M基因以及7a基因序列(登录号:DQ112226.1)设计通用引物以进行PCR：

CCoV-MF:5’-GCAACAGGATGGGCTTAC-3’

CCoV-7aR:5’-GCATGGAGGAAAACGAGC-3’