[发明专利]一种哺乳动物胚胎的性别鉴定方法

说明书

本发明为一种哺乳动物胚胎的性别鉴定方法。一种哺乳动物胚胎的性别鉴定方法，包括以下步骤：(1)获取胚胎；(2)获取胚胎细胞基因组DNA；(3)设计与合成引物；(4)QPCR反应：在PCR反应体系中，加入荧光染料；(5)扩增曲线并分析后，鉴定胚胎性别。本发明所述的一种哺乳动物胚胎的性别鉴定方法，为运用实时荧光定量PCR方法，设计简单，仅需要一对引物，能够通过熔点曲线分析检验扩增反应的特异性，灵敏度高，耗时短，低的初始成本，通用性好，并且具有自动化程度高等优点。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种哺乳动物胚胎的性别鉴定方法。

背景技术

哺乳动物的性别决定和控制的研究是分子胚胎学的重大课题，具有重要的理论意义和实际应用价值。家畜性别决定的掌握和控制，是可以显著提高家畜繁育效率的生物技术。性别控制的方法，包括X、Y精子分离法和胚胎性别鉴定法以及控制授精环境。X、Y精子分离法在分离过程会损伤精子，尤其对于较脆弱的绵羊精子，效果并不理想；并且仪器价格比较昂贵，一般实验室难以配置。调节母畜子宫的内环境，即授精环境方法还需进一步研究和完善。胚胎性别鉴定作为性别控制方法的一部分，是目前主要采用的途径，由个体水平、细胞水平发展到分子水平。

细胞学方法主要通过分析部分胚胎细胞的染色体组成(雌性为XX，雄性为XY)判断胚胎性别。免疫法(即细胞毒性分析法、间接免疫荧光法和囊胚形成抑制法)主要根据雄性胚胎上存在特异性H-Y抗原，用H-Y抗血清或H-Y单克隆抗体检测，从而鉴定胚胎的性别。分子生物学方法(荧光原位杂交(FISH)法、环-酶恒温扩增(LAMP)法、PCR扩增法)根据雌雄间的特异性基因进行性别鉴定。PCR法简单快速、准确灵敏，成为目前应用最普遍和广泛鉴定方法。PCR法鉴定实质根据染色体上特异性基因片段合成引物，检测X/Y染色体特异性片段的有无，实现鉴定性别的目的。然而，由于其使用染色体以鉴定性别的检出率低、鉴定的时间长，往往也导致胚胎难免受损，而使移置后受胎率降低。

目前，微量胚胎细胞DNA为模板扩增雄性特异性DNA片段、ZFX/ZFY基因、SRY基因、和ALME基因等是PCR鉴定法主流趋势。动物性别鉴定及控制技术目前已取得一定成果，在畜牧业上产生了一定影响。但在方法上要更加探索快速简便、准确率高、费用低、便于大规模生产的技术方法。

可是，由于胚胎性别鉴定时需要切取部分胚胎细胞作为模板，会对胚胎造成一定的损伤。为了保证胚胎的存活率，尽可能少地切取胚胎细胞数量的同时，鉴定效果又不理想。因此，提高性别鉴定的灵敏度与鉴定效率及更稳定的鉴定效果，同时在方法上要更加探索快速简便、准确率高、费用低、便于大规模生产的技术，意义重大。

有鉴于此，本发明提出一种新的哺乳动物胚胎性别鉴定方法，为实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)荧光染料法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种哺乳动物胚胎的性别鉴定方法，该方法为实时荧光定量PCR法，设计简单，灵敏度高，耗时短，通用性好，能满足胚胎性别鉴定超微量模板的要求(即较高灵敏度)，依据扩增曲线能够完成胚胎性别鉴定，整个过程可进行数枚胚胎的鉴定。

为了实现上述目的，所采用的技术方案为：

一种哺乳动物胚胎的性别鉴定方法，包括以下步骤：

(1)获取胚胎；

(2)获取胚胎细胞基因组DNA；

(3)设计与合成引物；

(4)QPCR反应：在PCR反应体系中，加入适量荧光染料；

(5)扩增曲线并分析后，鉴定胚胎性别。

进一步地，所述的步骤(5)中，扩增曲线后，有雄性特异基因扩增曲线的胚胎为雄性，否则为雌性。

进一步地，所述的扩增曲线为胚胎DNA扩增曲线、胚胎DNA溶解曲线中的至少一种。