[发明专利]一种IGF-1的低成本制备方法及其应用

说明书

本发明公开一种IGF‑1的低成本制备方法，包括：S1：ELP‑IGF‑1质粒的构建；S2：工程菌的构建；S3：将上述工程菌培养于TB培养基，过夜诱导，收集菌体，超声破碎，低温离心取上清；S4：将上述步骤得到的上清于水浴加热，离心取沉淀部分；S5：沉淀部分用预冷Tris‑HCl缓冲液溶解，离心取上清；S6：过夜酶切；S7：酶切完成后，蛋白质溶液置于30℃下水浴加热，30℃离心后取上清，上清部分用磁珠结合TEV酶，离心回收磁珠，上清经冷冻干燥后即为IGF‑1。IGF‑1应用于促进细胞生长增殖。本发明提供了全新、无需任何色谱填料制备方法，所制备蛋白应于刺激含IGF‑1受体的细胞生长增殖。

技术领域

本发明属于蛋白质工程技术领域，具体涉及一种IGF-1的低成本制备方法及其应用。

背景技术

胰岛素样生长因子-1（insulin like growth factor，IGF-1）是生长激素IGF轴上最重要的生长因子之一。IGF-1是由70个氨基酸组成的单一多肽蛋白，分子量为7649 Da。IGF-1在肝脏中产生的合成代谢激素，能刺激多种细胞类型的增殖和分化，并在组织更新和修复中发挥重要作用。IGF-1可对体细胞生长的调节，研究表明它参与哺乳动物的各种生理进程。此外相关研究也表明IGF-1在细胞能量代谢以及生长和发育中起着至关重要作用。基于IGF-1参与细胞各类重要代谢进程，IGF-1是细胞培养基不可或缺的组分。相关市场调研表明，在细胞培养基市场中IGF-1需求量巨大。

商品化的IGF-1来源途径主要有真核表达系统以及原核表达系统。有研究显示采用真核表达系统的动物细胞可表达出有生物活性的IGF-1；而细胞表达系统复杂，培养成本高昂。常规原核表达系统如大肠杆菌（E.coli），因含70个氨基酸的IGF-1有6个半胱氨酸，以及大肠杆菌内部的氧化环境，6个半胱氨酸极易发生二硫键错配而形成包涵体，IGF-1包涵体复性难以获取有活性的蛋白。

已有研究报道中，IGF-1表达后，均采用色谱分离进行纯化IGF-1。色谱分离方法需经上样，结合，洗涤，洗脱等多重步骤，耗时耗力，加之色谱分离方式在工业应用时难以实现规模放大，色谱分离法所需要填料价格高企。基于经济效益，特别是考虑工业级别的制备成本，优化来自大肠杆菌的IGF-1可溶性表达以及采用非色谱法纯化可能是最佳的选择。

综上，提高IGF-1可溶性表达，快速且简易纯化蛋白，并产生的有活性的IGF-1，大幅度削减制备成本，是本发明要解决的主要问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种IGF-1的低成本制备方法及其应用，以解决上述技术背景中所提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供以下技术方案：一种IGF-1的低成本制备方法，按照先后顺序包括以下步骤：

S1：ELP-IGF-1质粒构建：构建ELP-IGF-1质粒，其中ELP-IGF-1基因序列如SEQ IDNO：1所示；

S2：工程菌的构建：将上述ELP-IGF-1质粒转入BL21(DE3)大肠杆菌中，得到工程菌；

S3：将上述工程菌培养于TB培养基，当OD值达到0.5值，温度调为23℃过夜诱导，收集菌体，超声破碎，4℃离心取上清；

S4：将上述步骤得到的上清30℃下水浴加热，30℃离心，取沉淀部分；

S5：将沉淀部分用预冷的Tris-HCl缓冲液溶解，4℃离心取上清；

S6：上清加入带His-Tag的TEV酶，4℃过夜酶切；

S7：酶切完成后，蛋白质溶液置于30℃下水浴加热，30℃离心后取上清，上清部分用带镍的磁珠结合游离的TEV酶，离心回收磁珠，上清经冷冻干燥后即为IGF-1。

在步骤S1中，所述ELP-IGF-1质粒构建步骤如下：