[发明专利]一种检测试剂盒、检测工具及其在预测阿尔兹海默病中的用途

说明书

本发明涉及一种生物技术领域，尤指一种阿尔茨海默病预测标志物检测试剂盒。该试剂盒可以检测研究报道与阿尔茨海默病相关的口腔微生物，包括细菌(牙龈卟啉单胞菌、幽门螺杆菌、福赛坦氏菌、普氏杆菌、具核梭杆菌、螺旋体)、病毒(单纯疱疹病毒1型、巨细胞病毒、人类疱疹病毒6型、EB病毒)和真菌（白色假丝酵母菌、光滑假丝酵母菌）。检测方法是：从牙龈下方采集的样本提取DNA，文库制备，运用下一代测序（NGS)技术进行宏基因组测序分析。本发明之一种阿尔茨海默病预测标志物检测试剂盒能一次性检测出口腔所有的微生物，具有简便、高效、准确等优点，有利于对阿尔茨海默病的早期预防治疗，具有很大的临床应用价值。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种阿尔茨海默病预测标志物检测试剂盒与检测工具。

背景技术

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一种起病隐袭、呈进行性发展的神经退行性疾病，临床特征主要为认知障碍、精神行为异常和社会生活功能减退。阿尔茨海默病在65岁以上的人群中发病率最高，随着我国人口老龄化的进展，若没有很好的治疗方法，预计在未来几十年阿尔茨海默病的增加比例将更加迅速，将导致家庭和社会承担巨大的经济负担。目前尚无治愈阿尔茨海默病的有效手段。阿尔茨海默病的症状进展缓慢，并随着时间逐渐恶化。因此，发现经济、方便的阿尔茨海默病预测标志物对于提供更好的阻碍阿尔茨海默病进展的机会是至关重要的。有研究报道β-淀粉样蛋白积聚形成的有毒斑块导致了阿尔茨海默症，且多项证据表明，阿尔茨海默病患者大脑中Aβ和tau蛋白的异常积累早在痴呆症状出现前年即已经开始。

近年来的研究已经证实，人体内共生微生物种类与数量与阿尔茨海默病的发生与发展密切相关，中国专利申请CN201880066002.7公开了一种通过细菌宏基因组分析来诊断阿尔茨海默氏症的方法，其使用人体血液样品，对细菌的细胞外囊泡进行宏基因组分析来预测轻度认知障碍和阿尔茨海默氏症发作的风险，可早期诊断和预测阿尔茨海默氏症风险群体以利用适当的治愈延迟该疾病发作的时间或防止该疾病发作，并且在该疾病发作之后，可进行早期诊断，从而降低阿尔茨海默氏症的发生率并提高治疗效果。然而该技术存在以下的缺陷：一、由于检测样本为血液，必须采用介入式采集方式，无法在短期内进行多次测量，从而增加了单次检测假阳性的风险，提高了误诊的发生率；二、检测对象是人体血液样本的细胞外囊泡，样本处理操作复杂，成本高；三、检测的标志物仅针对各种不同种属细菌的细胞外囊泡，指标相对单一，如果出现菌群失调情况，可能导致检测结果不准确，从而增加误诊的可能。

本研究团队发现阿尔茨海默病患者的大脑中存在多种口腔致病微生物种群，如：细菌(牙龈卟啉单胞菌、幽门螺杆菌、福赛坦氏菌、普氏杆菌、具核梭杆菌、螺旋体)、病毒(单纯疱疹病毒1型、巨细胞病毒、人类疱疹病毒6型、EB病毒)和真菌(白色假丝酵母菌、光滑假丝酵母菌)，如附图1所示，这些口腔微生物种群可因感染、外伤或医源性因素进入血液，突破血脑屏障直接进入大脑，产生有毒物质引起炎症反应，进一步引起Aβ沉积、tau 蛋白过磷酸化，最终对神经元产生不可逆损伤甚至导致神经元凋亡。口腔样本采集方便，但鉴于口腔微生物种类繁多且口腔微生物种群随环境变化、食品卫生等外界因素波动幅度较大，检测结果偏差较大，易产生假阳性，因此制约着利用口腔微生物检测阿尔茨海默病患病风险的技术发展。

有鉴于此，针对上述技术问题，本发明提出一种设计合理、采样便捷、便于持续动态监测且精确度更高的阿尔茨海默病预测标志物检测试剂盒和检测方法。

发明内容

为了解决上述问题，本发明利用宏基因组测序，可以检测口腔中存在的所有稳定微生物，从而获得测试样本与阿尔茨海默病相关的全面信息。

具体技术方案是：

本发明在第一方面涉及用于选择自口腔稳定微生物中的AD生物标志物的检测工具在制备通过包括以下的方法诊断受试者中的阿尔兹海默症(AD)或确定受试者中发生阿尔兹海默症(AD) 的风险的试剂或试剂盒中的用途：

(1)口腔稳定微生物样本获取

(2)样本基因文库制备与扩增；