[发明专利]基于外周血的NK细胞体外培养方法

说明书

本发明公开了基于外周血的NK细胞体外培养方法，包括以下步骤：取用外周血和B958细胞备用，利用外周血经分离液处理后获得PBMC细胞，利用B958细胞获得含有EB病毒颗粒的EBV上清液，将所得PBMC细胞利用EBV上清液转化为永生化EBV‑LCL细胞，利用所得PBMC细胞经磁珠分选分离获得纯化后的NK细胞，将NK细胞经原代培养后置于无血清培养基中进行传代培养，获得增殖后的NK细胞。本发明的有益效果是：利用B958细胞制备含有EB病毒颗粒的EBV上清液，获得永生化EBV‑LCL细胞，使得NK细胞具有无限增殖能力，同时具有较强的杀伤肿瘤细胞的能力，NK细胞的扩增采用无血清培养基，避免血清源性污染以及避免血清批次间的质量变动，提高细胞培养和实验结果的准确性。

技术领域

本发明涉及外周血细胞培养，具体为基于外周血的NK细胞体外培养方法，属于细胞培养技术领域。

背景技术

人体免疫系统中，自然杀伤细胞(natural killere cell，NK)是机体重要的免疫细胞，大约占人外周血淋巴细胞的10％-15％，不仅与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节有关，而且在某些情况下参与超敏反应和自身免疫性疾病的发生，能够识别细胞、杀伤介质。

NK细胞在形态上属于大颗粒淋巴细胞，来源于骨髓，是除T细胞、B细胞之外的第三大淋巴细胞，和T细胞、B细胞不同的是，它不需要相关抗原刺激，就能识别和杀伤肿瘤细胞以及病毒感染细胞等靶细胞，NK细胞有两方面抗癌作用；一是直接杀伤肿瘤细胞，通过释放后穿孔素和颗粒酶或通过死亡受体杀死肿瘤细胞；二是通过分泌细胞因子和趋化因子扮演免疫系统的调节细胞因子，激活T细胞等的杀伤作用。

NK细胞作为人体免疫的第一道防线，几乎所有的肿瘤细胞都会先受到NK细胞的攻击，并及时将情况迅速上报并启动整个免疫系统的免疫防御和免疫杀伤功能，具有广谱的抗肿瘤作用，不需要肿瘤特异性识别，且不会被细胞表面的主要组织相容性复合体(MHC)抑制活性限制，启动时间最快。

肿瘤细胞表达的针对NK细胞免疫检查点的配体，仍然能够抑制NK细胞介导的肿瘤细胞裂解。于是NK细胞功能缺失，肿瘤逃逸，病情加剧。因此目前有一些新的药物被研发出来，针对肿瘤-NK细胞的抑制性免疫检查点，以限制这种抑制作用。

NK细胞可以通过两种方式克服抑制，一是激活型细胞因子，比如IL-2、IL-15，二是CD16(FcγRIII)介导的NK细胞激活。

IL-2可在短时间内促进NK细胞的存活、激活和提高细胞毒性，但是单独使用效果并不显著，同时尽管IL-2能够激活NK细胞，但它也可以增强Treg的活性，限制NK细胞的响应。IL-15被用于实体瘤的治疗，以及在白血病患者中，维持NK细胞数量和活性。IL-15一方面能够协助越过免疫检查点的一直机制，另一方面能够完善NK细胞上CD16介导的功能，而IL-2和IL-15联合应用可促进NK细胞的增殖和活性，有利于NK细胞的激活，IL-2和IL-15诱导NK细胞火花手提NKG2D、NKp44、NKp30和NKp46的表达，提高其对肿瘤细胞株的细胞毒性。

已有大量研究表明NK细胞与多种癌症相关，其中包括肝癌、晚期结肠癌、急性髓系白血病、急性白血病和霍奇金淋巴瘤等。为获得杀伤肿瘤细胞的效果，需要大量的NK细胞，但难以保证从肿瘤患者中能够获得大量血液，体外培养中多使用血清培养，其中血清组分尚不完全清除，同时不同批次血清的变动为实验研究带来不稳定性，降低实验研究结果的准确性，血清也可能会带来血清源性污染等问题。

发明内容

本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供基于外周血的NK细胞体外培养方法。

本发明通过以下技术方案来实现上述目的，基于外周血的NK细胞体外培养方法，包括以下步骤：

步骤一：取用外周血和B958细胞备用，利用外周血经分离液处理后获得PBMC细胞，利用B958细胞获得含有EB病毒颗粒的EBV上清液，将所得PBMC细胞利用EBV上清液转化为永生化EBV-LCL细胞；