[发明专利]基于外周血的NK细胞体外培养方法

权利要求书

1.基于外周血的NK细胞体外培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一：取用外周血和B958细胞备用，利用外周血经分离液处理后获得PBMC细胞，利用B958细胞获得含有EB病毒颗粒的EBV上清液，将所得PBMC细胞利用EBV上清液转化为永生化EBV-LCL细胞；

步骤二：利用所得PBMC细胞经磁珠分选分离获得纯化后的NK细胞；

步骤三：将NK细胞经原代培养后置于无血清培养基中进行传代培养，获得增殖后的NK细胞。

2.根据权利要求1所述的基于外周血的NK细胞体外培养方法，其特征在于：所述步骤三中更换为无血清培养基的NK细胞处于对数生长中期，所述无血清培养基中加入了葡萄糖、胰岛素、青霉素、链霉素、含锌和铜的无机盐物质、促生长因子及激素、CD3抗体活化剂、吲哚美辛和酶抑制剂、转铁蛋白、必需氨基酸、非必需氨基酸和谷氨酰胺、丙酮酸钠、多聚赖氨酸、昆布氨酸等氨基酸。

3.根据权利要求1所述的基于外周血的NK细胞体外培养方法，其特征在于：所述步骤一中外周血的提供源自健康人体，所述外周血采用RPMI1640培养液，所述RPMI1640培养液中加入15％PBS和细胞因子，所述细胞因子包括IL-2、IL-15和IL-12，所述外周血制备PBMC采用ficoll分离液进行分离，所述分离需经过多次水平离心和清洗。

4.根据权利要求1所述的基于外周血的NK细胞体外培养方法，其特征在于：所述步骤一到三中PBMC的分离、B958细胞的培养和NK细胞的培养均需在37℃、5％CO₂条件下进行。

5.根据权利要求1所述的基于外周血的NK细胞体外培养方法，其特征在于：所述步骤一中B958细胞培养于RPMI1640培养液中，所述RPMI1640培养液内加入10％胎牛血清、50U/ml青霉素和50μg/ml链霉素。

6.根据权利要求1所述的基于外周血的NK细胞体外培养方法，其特征在于：所述步骤一中B958正常传代培养后调整为细胞密度为1×10⁶个/ml，置于无血清RPMI1640的培养基中饥饿处理10-15d后获得EB病毒颗粒，经过离心过滤后收集于-80℃的条件下进行储存。

7.根据权利要求1所述的基于外周血的NK细胞体外培养方法，其特征在于：所述步骤一中永生化EBV-LCL细胞的生长方式为悬浮生长，所述永生化EBV-LCL细胞的制备需要在培养瓶内进行培养。

8.根据权利要求1所述的基于外周血的NK细胞体外培养方法，其特征在于：所述步骤二中磁珠分选需在冰上进行，所述磁珠分选需要使用磁珠试剂盒。

9.根据权利要求1所述的基于外周血的NK细胞体外培养方法，其特征在于，所述NK细胞的培养包括以下步骤：

S1：抽取人外周血5-10ml于一个离心管中，然后加入等量的PBS充分混匀稀释，加入ficoll溶液，外周血在ficoll的作用下分层，经过离心、弃上清得到PBMC细胞；

S2：将B958细胞放入RPMI 1640培养液中正常传代培养，然后将培养后的B958细胞的细胞密度调整为1×10⁶个/ml，在无血清RPMI 1640培养基中经饥饿处理7-10d后获得含有EB病毒颗粒的EBV上清液；

S3：将分离后的PBMC细胞移入EBV上清液中，加入RPMI1640培养液，充分混匀后移入培养瓶中，置于37℃，5％CO₂条件下进行培养，获得永生化EBV-LCL细胞；

S4：将上述所得的PBMC细胞移入试管中，依据磁珠试剂盒的说明书进行操作，所得到的即为高度纯化后的NK细胞；

S5：操作者取上述步骤分离纯化后的NK细胞，用含10％胎牛血清的RPMI1640的培养液进行原代培养，使用PBS洗3次，离心，弃上清，置于无血清培养基中进行传代培养，离心、弃上清后得到扩增后的NK细胞。

10.根据权利要求1所述的基于外周血的NK细胞体外培养方法，其特征在于：所述步骤三中体外培养扩增后的NK细胞需要进行性能检测，其中包括免疫表型的检测和NK细胞杀生能力的检测。