[发明专利]一种合成固定化脂肪酶及其拆分扁桃酸对映体的新方法

说明书

本专利介绍了以NH₂‑Ni‑MOF为载体固定荧光假单胞菌脂肪酶，用1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐和N‑羟基琥珀酰亚胺活化脂肪酶的羧基，通过共价键法合成固定化酶PFL@NH₂‑Ni‑MOF的合成方法。以PFL@NH₂‑Ni‑MOF为生物催化剂，在酯交换拆分扁桃酸对映体反应中，固定化酶展现了优异的催化活性，总转化率可高达49.18%，产物对映体过剩量值为97.90%，相同条件下，固定化酶的反应速率是游离酶的1.83倍。该固定化酶具有优异的重复使用性能，在重复使用10次后，仍然保持其初始活性50.18%的催化效率。本专利提供的制备方法具有明显的技术优势。共价键法可以增强游离脂肪酶与载体的相互作用，与游离酶相比，固定化酶热稳定性高，对pH耐受度高，便于循环使用，显著降低了技术成本，而且操作简便，绿色环保。

技术领域

本发明属于生物催化技术领域，利用生物催化法制备光学纯手性化合物，利用共价键法将荧光假单胞菌脂肪酶（PFL）固定在NH₂-Ni-MOF上，制备固定化酶(PFL@NH₂-Ni-MOF)，进而利用PFL@NH₂-Ni-MOF作为生物催化剂通过酯交换反应实现立体选择性拆分扁桃酸对映体。

背景技术

扁桃酸是一种重要的医药、染料、农药、精细化工中间体。(R, S)-扁桃酸不同构型具有不同的药理活性，(R)-扁桃酸是用于头孢菌类抗生素（cephamandole），中枢神经兴奋药物匹莫林（pemoline），抗肿瘤药物（(+)-goniodiol），抗肥胖药物（phenethanolamine）等的合成；而且(R)-扁桃酸是重要的手性催化剂和手性拆分剂，被称为“万能”拆分剂。(S)-扁桃酸是用于合成治疗尿频、尿急、尿失禁药物(S)-奥昔布宁（(S)-oxybutynin）的原料。随着手性制药工业的快速发展，对光学纯扁桃酸的需求以每年10%左右的速度增加，所以拆分(R, S)-扁桃酸具有重要意义。目前拆分外消旋扁桃酸对映体主要有以下几种方法：非对映体结晶拆分法、色谱拆分法、毛细管电泳法、萃取拆分法、酶催化拆分法。其中，酶催化拆分因为其绿色、高效、高立体选择性等优点，被认为是最具潜力实现工业化生产的方法。

酶催化拆分具有高立体选择性、区域选择性和专一性，催化反应后得到高产率、高选择性的目标对映体，同时反应过程具有绿色、温和等显著优势，是一类极具发展潜力的手性拆分技术。但动力学拆分主要采用游离酶，面临着酶与产品分离难度大，难以循环利用，反应过程中蛋白质容易变性，对温度、pH等反应条件要求苛刻等一系列难题。因此，针对游离酶催化动力学拆分面临的难题，酶的固定化是酶催化技术的重要发展方向之一。

载体在固定化酶的制备过程中起决定性的作用，在合成固定化酶的过程中，要根据游离酶的特性和固定化方法，选择合适的载体。一般而言，固定化酶载体需要具备以下几个特征：（1）稳定性：材料结构稳定，具有一定的耐酸、碱性，在酶催化反应过程中，不与底物、产物及介质发生反应；（2）具有生物相容性：不会破坏酶的立体结构，有利于酶活的发挥；（3）良好的渗透性：有利于底物与产物透过。针对酶的固定化已经被广泛报道，可供选用的载体较多，如溶胶-凝胶基质、水凝胶、有机微粒以及介孔二氧化硅等。但这些载体都存在一定的缺陷，如溶胶-凝胶基质容易导致酶变性，且底物在其内部传质受限；由于易发生膨胀和降解，固定于水凝胶、有机微粒上的酶容易流失、变性，且传质效率低；介孔二氧化硅虽然具有多方面的优点，但也存在结构无法合理设计，表面容易发生改变从而使酶变性或流失等问题。

固定化载体的选择上，MOFs具有高比表面积、孔体积、易调节的孔道尺寸，以及良好的热稳定性且合成条件较温和等优点。以上这些优点使得MOFs成为非常有潜力的一类酶固定化载体。