[发明专利]一种基因编辑单细胞的快速筛选方法

说明书

本发明公开了一种基因编辑单细胞的快速筛选方法，包括将单一细胞于96孔细胞培养板中进行扩大培养后，取出部分细胞悬液置于96孔PCR板中；将96孔PCR板进行密封、离心、静置、再离心，采用96孔吸液板吸去上清液；在去除上清液的96孔PCR板中加入PH为8.0的1xTE buffer缓冲液，密封96孔PCR板后，于95℃下处理8～12min，再进行离心处理，收集上清，即得细胞基因组DNA；以细胞基因组DNA为模板扩增包含基因编辑位点的基因片段，再进行测序，根据测序结果确认基因编辑的单细胞；该方法将96孔培养板中的细胞一一对应96孔PCR板，再经DNA提取后直接进行PCR扩增，该方法操作简单、省时省力，并且避免了人为编板号错误的问题。

技术领域

本发明涉及细胞筛选技术领域，具体涉及一种基因编辑单细胞的快速筛选方法。

背景技术

聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)，是一项利用DNA双链复制的原理，在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。通过这一技术，可在短时间内大量扩增目的基因，而不必依赖大肠杆菌等生物体，现已成为分子生物学中应用最广泛的技术之一。目前应用的聚合酶链式反应需要几个基本组成：

1)DNA模板(template)：含有需要扩增的DNA片段；

2)2个引物(primer)：决定了需要扩增的起始和终止位置；

3)DNA聚合酶(polymerase)：复制需要扩增的区域；

4)脱氧核苷三磷酸(dNTP)：用于构造新的互补链；

5)含有镁离子的缓冲体系，提供适合聚合酶行使功能的化学环境。

基因编辑(Genome Editing)又称基因组工程，是遗传工程的一种，是指在活体基因组中进行DNA插入、删除、修改或替换的一项技术。随着科学技术不断进步，基因编辑技术已经日益成熟，想要实现对基因组的编辑变得不再那么困难，特别是2013年第三代技术CRISPR/Cas9的出现，目前被认为是最简单的基因编辑手段。其作用原理：通过人工设计的gRNA(guide RNA)识别目的基因组序列，并引导Cas9蛋白酶进行有效切割DNA双链，形成双链断裂(double-strand breaks,DSB)，损伤后修复会造成基因敲除或敲入等情况，以此达到基因编辑的目的。DSB可以激活细胞的内源性DNA修复机制，主要包括非同源末端连接(non-homologous end joining,NHEJ)以及有模板DNA存在的同源重组(homologydirected repair,HDR)两种修复方式。NHEJ的修复效率虽平均高达98％以上，但比较容易出错，藉此会实现靶点处DNA的缺失(deletion)或插入(insertion),进而通过改变阅读框来破坏靶基因的表达，最终导致产生非功能性蛋白或mRNA降解，以实现基因敲除的目的。然而对于大多数疾病的研究，则需要通过基于平均效率不到2％的HDR精确基因编辑方式，来实现致病性基因突变的修复。

为了验证某一候选SNP(single nucleotide polymorphism)位点是否具有一定的功能，人们通常会选择癌细胞在细胞水平上利用CRISPR/Cas9技术的HDR修复方式，来对细胞进行基因编辑。进而通过有限稀释法或流式细胞仪等手段将基因编辑过的细胞，逐一挑选至细胞96孔板培养7～10天。之后将生长起来的单一细胞克隆挪至相对应的六孔板中再次培养10～15天，以便有足够数目的细胞来进后续细胞基因组DNA的提取及留种，由于样品数量较多，因此基因组DNA提取的工作量无疑将是更大的。为了不影响后续的PCR过程，还需要将提取出的细胞基因组DNA样本重新排序，分装至96孔PCR板中，以便可以尽可能快地完成PCR反应体系的配制。从在96孔细胞培养板中培养细胞开始至PCR反应的进行，不仅耗时长所需成本高，而且工作量也非常的大，很容易出现人为错误，导致基因组样本DNA无法与留种的细胞样本相匹配。

发明内容