[发明专利]一种检测mRNA加帽效率的方法

说明书

本发明公开了一种检测mRNA加帽效率的方法。本发明提供了一种检测mRNA加帽效率的方法：(1)将供试mRNA与DNA探针杂交；(2)进行RNase酶解；(3)进行DNase酶解；(4)进行毛细管电泳，计算加帽效率。DNA探针为单链DNA分子，由15‑25个核苷酸组成，与供试mRNA的5’UTR中的特异区段反向互补；特异区段位于供试mRNA的5’UTR的5’末端第10‑85位核苷酸区间中。RNase具有特异性切割由DNA和RNA形成的杂合双链中的RNA的功能。本发明为mRNA疫苗生产的质量控制提供一个高效、低成本的加帽率的快速测定方法，具有重要的开发价值和广泛的应用前景。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种检测mRNA加帽效率的方法，尤其适用于mRNA疫苗的加帽效率的质控检测。

背景技术

对于新型冠状病毒的高突变，预防性疫苗的开发尤为重要。自病毒爆发以来，美国BioNtech/Pfizer和Moderna公司首次推出针对新冠病毒的mRNA疫苗，作为应对突发疫情的有效手段，mRNA疫苗获得了FDA和EMA批准，目前已在北美和欧洲广泛接种。mRNA疫苗是采用体外转录技术，依赖T7 RNA聚合酶以及DNA模板，在体外环境中转录出mRNA序列，可大量表达目的蛋白。mRNA的主要结构包括5’Cap、5’UTR、ORF区、3’UTR以及polyA尾(示意图见图1)，除了5’Cap，其他结构均可直接构建在质粒模版上，通过体外转录完成扩增，唯独帽结构需要单独连接在mRNA上。在真核细胞中，细胞会在自身转录出来的mRNA的5’端加入一个7-甲基鸟苷的帽子结构，即m7GPPPN结构，它能够结合翻译元件介导蛋白翻译过程，同时防止mRNA被核糖核酸外切酶降解。

目前的RNA加帽方案主要有两种方法：一种是通过牛痘病毒加帽酶以及甲基转移酶对体外转录出来的mRNA进行Cap1修饰，该方法操作步骤多且成本较高；另一种是TriLink公司研发的CleanCap帽结构，可在体外转录反应过程中将其掺入至RNA，能形成94％含有Cap1结构的mRNA，该方法操作简单成本相对较低，在未来具有广阔的应用前景。

无论应用上述的任一方案，都存在一个加帽效率问题。加帽效率直接决定着mRNA的表达水平，所以在mRNA疫苗生产过程中需要实时监测每批产品加帽效率。目前，现有技术中检测加帽效率的方法主要包括LC-MS检测法以及qSL-RT-PCR法。LC-MS检测法分析精度准，但实验周期长、价格较高。qSL-RT-PCR法同样存在操作周期较长的问题，而且精度较差。因此，开发一个操作周期较短、检测灵敏度高的加帽效率检测方法尤为重要。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测mRNA加帽效率的方法。

本发明提供了一种检测mRNA加帽效率的方法，依次包括如下步骤：

(1)将供试mRNA与DNA探针杂交；

(2)进行RNase酶解；

(3)进行DNase酶解；

(4)进行毛细管电泳，计算加帽效率。

具体的，所述RNase为RNaseH。

所述方法中，供试mRNA和DNA探针的配比为：2μg：10-30pmol。

所述方法中，供试mRNA和DNA探针的配比为：2μg：20pmol。

所述方法中，供试mRNA、DNA探针、RNase、DNase的配比依次为：2μg：10-30pmol：4-6U：1-3U。

所述方法中，供试mRNA、DNA探针、RNase、DNase的配比依次为：2μg：20pmol：5U：2U。

所述步骤(1)中，DNA探针与供试mRNA中的反向互补区形成DNA-RNA杂合区段。