[发明专利]一种用于移植患者感染的病原体检测引物和探针组、试剂盒及应用

说明书

本发明公开一种用于移植患者感染的病原体检测的引物和探针组、试剂盒及应用，属于分子生物学检测技术领域。包括23组引物探针组合，可用于联合检测移植术后感染率和致死率均较高的腺病毒B型等23种病原体，其中，对应探针组各序列的两端分别带有对应的荧光基团和淬灭基团；另提出一种移植患者感染的病原体检测实时荧光定量PCR试剂盒，包括所述的引物和探针组、病原体质粒标准品、荧光定量PCR反应液和无菌去离子水，可同时检测移植患者感染的23种病原体。本发明中设计的PCR扩增引物具有良好的敏感性和重复性，检测下限低，能对移植患者术后感染有较全面的检测，对降低移植患者的病死率有重要的临床参考意义。

技术领域

本发明涉及一种病原体检测的引物和探针组，尤其涉及一种用于移植患者感染的病原体检测的引物和探针组、试剂盒及应用，属于分子生物学检测技术领域。

背景技术

移植手术已广泛应用于临床，可以治疗许多恶性肿瘤，但随着移植手术的广泛应用，免疫抑制剂的使用降低了移植受体发生免疫排斥反应的风险，同时也抑制了受体的免疫水平，进而导致受体感染病原体的风险增加。

如今，移植术后感染性并发症的问题日益突出，其为造成实体器官移植（SOT）和造血干细胞移植（HSCT）后最常见和最重要的发病和死亡原因，其中，在实体移植群体中，真菌感染与重大并发症有关，念珠菌血症相关的大致死亡率高达37%，一项对250例原位肝移植术后感染患者的资料进行回顾性分析，发现感染率为65.2%，死亡率为13.5%；造血干细胞移植后感染部位主要为肺部，感染概率高达40-60%，且有文献报道感染是造成20%患者异体造血干细胞移植（HCT）后死亡的原因。

导致移植后感染主要包括：基础疾病因素、造血干细胞移植后免疫抑制状态和移植物抗宿主病（GVHD）三个方面；临床上最常见的感染是巨细胞病毒感染和细菌感染。从源头控制造血干细胞移植和实体器官移植后感染的发生，对提高移植成功率，降低血液系统疾病、实体瘤、自身免疫性疾病等疾病的死亡率有重要意义，因此，研发一种快速、准确性高的检测方法至关重要，其可减低移植术后病死率。但当移植受体术后发生病原体感染时，有许多检测方法都具有局限性。

目前，常用的病原体检测方法包括：

一、培养法，具有金标准，特异性高，方法简单的优点；但培养周期长，费时费力，有些病原体难以培养；

二、SYBR Green I法，灵敏度高，但容易产生引物二聚体和非特异扩增，因此其假阳性率高，特异性低；

三、微滴数字PCR法，灵敏度高，特异性；但价格昂贵；

四、二代测序法，灵敏度高，特异性高；但操作复杂，成本高；

五、Taqman实时荧光定量PCR法，克服了SYBR Green 法的假阳性率高和特异性低的缺陷，其更适用于病原体的联合检测，即一次性检测多种病原体。

论文“基于二代测序技术平台检测器官移植术后病原微生物的应用研究，王啸晨，2020年”中公开采用多重PCR检测临床病原微生物，以及，二代测序技术检测器官移植术后病原体。

专利文献“CN101351559，病原体的多元定量检测”中，采用多重PCR法，实现同时检测多个病原体，但还存在如下的技术问题：

1）理论上，能在反应体系中加入多对引物对，同时检测多种病原体；但在实际情况下很受限制，一般能同时检测5-6种病原体；

2）对引物设计的要求极高。因为是多对引物在同一个反应体系，所以要确保引物之间不会形成引物二聚体，或者导致非特异性扩增；

3）反应体系的优化较困难。由于在一个多重PCR反应体系中有多对引物，且扩增的模板片段长度也不尽相同，所以各对引物的扩增效率和扩增速度也不相同。由于多重PCR反应总是遵循较小片段优先扩增的原则，各对引物所要求最佳PCR条件也不尽相同（设计多对引物进行多重PCR扩增时，应使各引物所需PCR扩增条件尽可能一致），因此在选择多重PCR扩增条件（尤其是退火温度和时间）时，应尽量选择有利于较大片段扩增的条件。

发明内容