[发明专利]一种高产顺式-冷杉醇的重组大肠杆菌、构建方法及其应用

说明书

本发明公开了一种高产顺式‑冷杉醇的重组大肠杆菌、构建方法及其应用，所述高产顺式‑冷杉醇的重组大肠杆菌，能够同时表达激酶基因ScCK、MtIPK或SfPhoN、MtIPK以及萜类前体合成基因IDI、Erg20。本发明所述基因工程菌是通过代谢工程的方法对大肠杆菌中DMAPP合成相关基因进行调整，又在其基因组中进行敲除改造得到的。利用该菌株以戊烯醇为主要碳源时进行摇瓶发酵可在72h内累计达311.8mg/L，相比之前报道的传统MVA途径积累的最高值提高了1倍；该菌株在1.3L发酵罐发酵136h可积累顺式‑冷杉醇达1375.7mg/L，相比现有的顺式‑冷杉醇工业化菌株提高了1.2倍，说明该菌株具有工业化生产顺式‑冷杉醇的潜力。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及到一种高产顺式-冷杉醇的重组大肠杆菌、构建方法及其应用。

背景技术

天然龙涎香是濒危物种抹香鲸产生的一种肠道排泄物，是最珍贵的香料之一，常被用作香味固定剂。目前，降龙涎香醚及其相关化合物被广泛用作龙涎香的替代品，主要由全化学合成获得，但其全化学合成步骤复杂，条件苛刻且选择性差。此外，降龙涎香醚还可由顺式-冷杉醇等其他来源于植物的含氧二萜化合物(如香紫苏醇)为前体半化学合成获得。其中，顺式-冷杉醇半化学合成法具有反应步骤少、选择性高、产率高等优点。

顺式-冷杉醇，是一种双环劳丹烷型二萜化合物，常存在于植物冷杉和烟草中，是大多数烟草和部分雪茄的香味前体，在食草动物和病原体的化学防御上也发挥着关键作用。顺式-冷杉醇的生产工艺主要有2种：植物提取法和代谢工程改造。顺式-冷杉醇在植物中含量极低，提取分离困难，植物提取法无法满足半化学法合成的需求。因此，具有原料可再生、产物单一、品质优异等优势的代谢工程改造微生物合成顺式-冷杉醇工艺，已经成为国际上的研究热点。

萜类的生物合成均来源于共同的前体—异戊二烯焦磷酸(Isopentenylpyrophosphate，IPP)和二甲基烯丙基二磷酸(Dimethylallyl pyrophosphate，DMAPP)。IPP和DMAPP通过法尼基焦磷酸合成酶(Farnesyl Pyrophosphate Synthase，FPPS)的催化生成一分子的法尼基焦磷酸(FPP)。IPP和FPP通过牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶(Geranylgeranyl Pyrophosphate Synthase，GGPPS)的催化生成一分子的牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(GGPP)。GGPP是二萜化合物的前体。然后以GGPP为底物，通过冷杉醇合酶生成顺式-冷杉醇。现有的代谢工程菌的冷杉醇产量较低，可能的原因是合成途径冗长，代谢负担过重。近年来，新型整合途径(利用异戊二烯一磷酸激酶，IPKs)逐渐应用于萜类的生产，其中IUP(异戊烯醇利用途径)途径因步骤简洁、辅因子简单、调控独立于中心碳代谢而备受关注。异戊烯醇(3-甲基-3-丁烯-1-醇)途径以异戊烯醇为底物，经过两步反应并消耗两分子ATP即可获得萜类通用前体IPP。IUP途径目前局限于两步反应有效酶的挖掘，在工程菌株体内的应用还未进一步优化，致使其未能满足商业应用的需求。

发明内容

本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本发明。

为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种高产顺式-冷杉醇的重组大肠杆菌，同时表达激酶基因ScCK、MtIPK或SfPhoN、MtIPK以及萜类前体合成基因IDI、Erg20。

作为本发明高产顺式-冷杉醇的重组大肠杆菌的一种优选方案，其中：所述ScCK基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述SfPhoN基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述MtIPK基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。