[发明专利]一种同时定量检测血清中3种急性心肌梗死相关microRNA荧光探针的制备方法

说明书

本发明公开了一种同时定量检测血清中3种急性心肌梗死相关microRNA荧光探针的制备方法：合成金属有机骨架Fe‑MIL‑88；发夹探针H1～H9与Fe‑MIL‑88发生荧光共振能量转移作用，发夹探针上标记的FAM(H1‑H3),TAMRA(H4‑H6),Cy5(H7‑H9)的荧光被猝灭，当存在目标物时，520nm处FAM的荧光随着目标物miR‑21浓度增加而增强，580nm处TAMRA的荧光随着目标物miR‑499浓度增加而增强，680nm处Cy5的荧光随着目标物miR‑133a浓度增加而增强；根据相应荧光强度对目标物的浓度进行定量检测。该方法灵敏度高、选择性好、检测简便。

技术领域

本发明属纳米材料、荧光传感技术和生物分析检测领域，具体涉及基于金属有机骨架的信号放大荧光传感平台同时定量测定血清中3种急性心肌梗死相关microRNA的方法。

背景技术

急性心肌梗死(AMI)伴有血管腔狭窄、急性持续缺氧缺血性心肌缺血和损伤，且可导致严重残疾和超高死亡率，是最常见的一类冠状动脉综合征。目前，高灵敏性心肌肌钙蛋白(hs-cTnT)被认为是诊断AMI的金标准。然而，在慢性稳定型冠状动脉疾病(应激性心肌病和血管痉挛型心绞痛)和终末期肾病(肾功能衰竭)中，血浆hs-cTnT也会有明显的升高。此外，在最新的高灵敏免疫测定法下，cTnT在6小时67左右才能有显著升高。因此，寻找更好的潜在生物标志物对于医学研究中早期快速、准确诊断AMI显得尤为重要。

MicroRNA是一种短的内源性非编码RNA(17-25个核苷酸)，通过调节基因转录后水平的表达，在生物过程中发挥重要作用。越来越多的证据表明，心肌组织特异性表达microRNA，如microRNA-21(miR-21)、microRNA-499(miR-499)、microRNA-208a和microRNA-133a(miR-133a)，且它们在循环中也高度稳定。值得注意的是，miR-21能够增强AMI中干细胞和祖细胞的功能，导致AMI后纤维形成和细胞肥大。而心肌和骨骼肌中的miR-499在生理上与心脏分化和I/R损伤相关，是再灌注损伤潜在的生物标志物。并且，miR-133a在早期分化、心脏发育和介导心脏传导、自律性、肥厚和心脏重构等过程中发挥着重要作用。此外，甚至在AMI事件后的1小时内，血浆和血清中相关microRNA的表达水平在患者血流中迅速显著上调。在这个意义上，这些microRNA可以被认为是AMI的早期诊断和快速预后潜在的生物标志物。目前，已有多种检测AMI相关microRNA的定量分析方法报道，如实时聚合酶链反应、微阵列、northern blot、表面增强拉曼光谱等。然而，由于microRNA尺寸小，丰度低和同源性高等特点，导致这些技术存在耗时及缺乏灵敏度的不足。另一方面，传统方法仅基于单一的AMI相关microRNA检测，不可避免地会产生假阳性或假阴性结果。为了克服这些障碍，迫切需要将信号放大技术与多路复用技术相结合。

为了进一步提高同时定量检测多个AMI相关microRNA的灵敏度，我们引入了纳米材料。近年来，由于纳米材料如金纳米颗粒、碳纳米管、氧化石墨烯、二硫化钼纳米片、金属有机框架(MOFs)等具有良好的结构和优异的光学性能而受到越来越广泛的关注。特别是MOFs，一种独特的新型纳米多孔有机-无机材料，具有超高的表面积、柔性孔隙率和良好的热稳定性。MOFs在催化、气体储存与分离、化学传感和药物递送等方面的应用已被广泛报道。此外，一些MOFs包括UiO-66和MIL-101已经被设计用于DNA传感。这些MOF对各种染料标记的单链DNA展现出极好的荧光猝灭能力以及对单链DNA和双链DNA有较好的区分能力。但是，基于MOFs和染料标记的DNA链的一步杂交的检测方法信号较弱，限制了其灵敏度。然而，借助催化发夹组装(CHA)辅助的目标物循环，可以有效放大检测信号，这有利于进一步提高灵敏度。据我们所知，通过结合CHA放大技术和金属有机骨架的荧光测定技术用于多路microRNA分析，具有极好的灵敏度和特异性，目前仍未被广泛探索。

发明内容