[发明专利]一种高敏感性和特异性强的日本血吸虫检测引物、探针、试剂盒及其应用

说明书

本发明提供了一种高敏感性和特异性强的日本血吸虫检测引物、探针、试剂盒及其应用，所述的试剂盒提供了一组敏感性高和特异性强的日本血吸虫检测用引物和探针。本发明构建了敏感性高和特异性强的日本血吸虫LFD‑RPA检测技术，可准确快速的检测日本血吸虫的感染。

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，具体涉及日本血吸虫核酸特异性基因G01的LFD-RPA的检测方法的建立，及其在检测日本血吸虫游离核酸中的应用。

背景技术

日本血吸虫（又称日本裂体吸虫）属于扁形动物门（Platyhelminihes）、吸虫纲(Trematoda)、复殖目（Digenea）、裂体亚目（Schistosomatata）、裂体超科（Schistosomatoidea）、裂体科(Schistosomatidae)、裂体亚科(Schistosomatinae)、裂体属(Schistosoma)。日本血吸虫生活史包括虫卵、毛蚴、母胞蚴、子胞蚴、尾蚴、童虫和成虫七个阶段，需要中间宿主钉螺（Oncomelania）和终末宿主（40余种哺乳动物）、且需要经过无性繁殖和有性繁殖的交替才能完成生活史循环。日本血吸虫成虫寄生在终末宿主的门静脉和肠系膜静脉，雌雄虫交配后产卵，虫卵随血流到肝脏或沉积在肠壁，经过数天发育为成熟虫卵，虫卵落入肠腔并随着粪便排出体外。虫卵在适宜环境下孵出毛蚴，毛蚴在水中侵入中间宿主钉螺，在钉螺体内发育至尾蚴阶段，然后成熟的尾蚴被不断逸出，与人或哺乳动物的皮肤接触即可感染。日本血吸虫终末宿主众多，包括人、黄牛、水牛、绵羊、山羊、猪、马等40多种哺乳动物，可对人类健康和畜牧业发展造成严重危害。

在我国，日本血吸虫病主要流行于长江流域的安徽、江苏、湖北、湖南、江西、四川等省份。其终末宿主黄牛、水牛、绵羊、山羊等家畜是日本血吸虫病传播的主要传染源，因此，做好家畜血吸虫病防治工作是我国早日消除日本血吸虫病的保证。目前，我国日本血吸虫病呈低度流行，这对该病诊断方法的敏感性、特异性、稳定性以及操作简便性有了更高的要求。

常用的血吸虫病诊断方法主要有病原学诊断、免疫学诊断和分子生物学诊断等。病原学诊断是血吸虫病诊断的金标准，具有经济、快捷、易操作等优点。但是随着我国消除血吸虫病进程的不断推进，流行区人和动物的血吸虫感染率和感染强度逐渐降低，病原学诊断存在的漏检率高、敏感性低等缺点，已逐渐不适用于低度流行地区。免疫学诊断具有较好的敏感性、方便快捷、稳定等优点，在流行病学调查、群体诊断等方面有着病原学诊断不可比拟的优势，是血吸虫病诊断的重要手段。但同时，免疫学诊断的交叉反应、较高的假阳性结果以及不能区分既往和现症感染等缺点制约了免疫学诊断在日本血吸虫病诊断上的发展。分子生物学诊断日本血吸虫病是通过检测宿主体内的日本血吸虫核酸片段来进行疾病诊断，该方法具有敏感性高、特异性强等特点。

日本血吸虫尾蚴侵入宿主后，在移行、发育、成熟、产卵等过程中，表膜等虫体成分进行更新、脱落，虫体细胞、部分虫卵会发生崩解，其核酸物质释放到宿主体内，因此，可通过这些核酸物质的检测来对宿主日本血吸虫病进行诊断。这些核酸物质包括循环无细胞DNA，长期以来一直被探索用于各种临床无创诊断。近20年来，母体血浆中循环无细胞DNA一直被用于诊断和监测一系列胎儿疾病和妊娠相关并发症。循环无细胞DNA主要存在于宿主血液、唾沫、尿液等体液中，这也是通过检测日本血吸虫核酸物质来诊断日本血吸虫病的分子基础。近些年已经有学者通过检测人血液中血吸虫循环无细胞DNA来诊断血吸虫病。

SUN等(2016)建立了LFD-RPA检测人日本血吸虫病方法，检测下限为5 fg日本血吸虫基因组DNA，敏感性为92.86％（13/14），特异性为100％（31/31）。XING等（2017）建立了real-time RPA检测人日本血吸虫病方法，检测下限为0.9 fg日本血吸虫基因组DNA，敏感性和特异性均为100％（30/30; 30/30）。而上述两种日本血吸虫病诊断方法检测模板都是来自人粪便样本中的虫卵基因组DNA，而在本研究中，检测模板是小鼠和山羊血浆样本中的cell-free DNA，在样本的来源和处理上，血浆样本更具有可操作性，便于后续的实验开展。