[发明专利]一种检测斑马鱼Acsl1a基因突变的方法

说明书

本发明提供了一种检测斑马鱼ACSL1a基因突变的方法，包括提取斑马鱼基因组DNA，引物扩增、Hpy188I内切酶、琼脂糖凝胶电泳分析步骤。本发明方法可以高效鉴别斑马鱼Acsl1a第7外显子TCTGA基因序列是否缺失，通过酶切条带的数量与片段大小分辨斑马鱼Acsl1a第7外显子TCTGA基因为野生型、缺失突变体或是杂合型个体；本发明方法简单、快速、对仪器设备的依赖度较低，极大地降低了鉴定成本，且能快速、准确地鉴定出杂合型样本，具有极大的应用、推广价值。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种检测斑马鱼Acsl1a基因突变的方法。

背景技术

长链脂酰CoA合成酶1(long-chain acyl-CoA synthetase1，ACSL1)能够催化长链脂肪酸生成相应的脂酰CoA，参与机体多种脂肪酸合成、代谢活动，是脂肪酸β氧化的关键酶。国家斑马鱼资源中心(China Zebrafish Resource Center,CZRC)设计并培育斑马鱼Acsl1a基因(Gene ID:555308)第7外显子TCTGA序列缺失突变体品系，编号为ZKO332a。该品系斑马鱼第1号染色体Acsl1a基因第7外显子TCTGA序列片段缺失，导致编码区出现移码突变，不能合成正确的ACSL1蛋白，生物学功能丧失。因此ZKO332a品系斑马鱼是研究动物及人类脂类代谢疾病理想的生物模型，是生物医学、分子生物学、鱼类学等学科常用的实验对象。在众多斑马鱼个体中，需要准确鉴别出Acsl1a基因第7外显子TCTGA序列缺失突变体品系，以便进一步进行实验研究。

目前最常用的鉴定基因片段序列插入、缺失的方法是Sanger测序或基于测序的荧光信号定量检测技术，以上技术需要依赖昂贵的仪器设备和试剂，鉴定成本较高(200元/样本，按照10元/反应，20个克隆子/样本计算，不包含PCR扩增和基因克隆产生的费用)。另外，在检测杂合型样本时，需要对该样本的两套染色体(拟定是二倍体生物)的待检测基因区段分别进行检测，在具体的实验方法上主要是对待检基因片段的PCR扩增产物进行体外克隆，随机选取若干克隆子进行测序，该方法成本高、操作复杂、试验周期长，且出现假阴性的概率较高。

因此，提供一种能快速、高效且成本低的鉴别斑马鱼Acsl1a第7外显子 TCTGA基因为野生型、缺失突变体或是杂合型个体的方法具有非常重要的意义和广泛的应用前景。

发明内容

本发明提供了一种检测斑马鱼Acsl1a基因突变的方法，包括如下步骤：

(1)提取斑马鱼基因组DNA；

(2)利用引物P1和引物P2对步骤(1)提取的DNA进行PCR扩增；所述引物P1为：5’-accgtggatggcttaagggtt-3’，引物P2为： 5’-gtgtcttgtggtttgctttgcca-3’；

(3)利用Hpy188I内切酶对步骤(2)的PCR扩增产物进行酶切；

(4)对步骤(3)的酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，分析酶切条带。

进一步地，上述检测Acsl1a基因突变是检测Acsl1a第7外显子TCTGA 基因序列是否缺失；步骤(4)所述酶切条带包含大小为471bp的条带，则存在Acsl1a基因突变。

进一步地，步骤(1)所述提取方法为酚-氯仿抽提法、高盐沉淀法、离心柱法、磁珠法；优选为酚-氯仿抽提法。

更进一步地，上述酚-氯仿抽提法包括如下步骤：将斑马鱼的尾鳍组织进行组织裂解和蛋白酶消化后，加入Tris平衡酚和氯仿混匀，离心，上清液加入异丙醇混匀后-20℃静置，离心弃液后风干。

进一步地，步骤(2)所述PCR扩增反应体系为：灭菌的去离子水26.5 μL；Buffer3.5μL，dNTP 3.0μL，引物P1和引物P2各0.5μL，DNA 1μL， rTaq 0.1μL；