[发明专利]一种产L-乳酸的重组菌及其应用

说明书

本发明公开了一种产L‑乳酸的重组菌及其应用，本发明的重组菌在酿酒酵母宿主中过表达了D‑乳酸脱氢酶Dld1基因，并采用来源于凝结芽孢杆菌的乳酸脱氢酶LDH基因替换丙酮酸脱羧酶Pdc1基因和丙酮酸脱羧酶Pdc6基因，采用来源于可合成L‑乳酸的乳酸乳球菌的L乳酸脱氢酶LLDH基因替换乙醇脱氢酶Adh1、甘油三磷酸脱氢酶1Gpd1或甘油三磷酸脱氢酶2Gpd2基因，敲除酿酒酵母中的转化乳酸为丙酮的L‑乳酸氧化还原酶基因Cyb2和羧基转运蛋白Jen1基因。通过本发明的生物改造技术，最终实现L‑LA的提升，摇瓶产量从最初的0.98g/L提升至29.55g/L，较原始耐酸菌株提高了30倍。

技术领域

本发明涉及一种产L-乳酸的重组菌及其应用，属于定向代谢技术领域。

背景技术

乳酸因具有光学异构特性，可以形成L-乳酸和D-乳酸。L-乳酸(L-LA，CH₃CHCOOH)是人和动物体内正常的代谢物，是一种天然的有机酸；广泛应用于食品、医药、化妆品、烟草及化工领域。同时，L-乳酸还可用来生产生物降解塑料-聚乳酸(PLA)和绿色环保溶剂-L乳酸甲酯、L-乳酸乙酯等。PLA是一种性能优异、价格合适的可降解材料。可降解塑料的需求量以年均复合增长33％的速率在增长，全球均处于发展早期，聚乳酸未来发展潜力巨大。因此，提升L-乳酸的生产能力及降低L-乳酸生产成本，对于促进全球可降解塑料产业的发展至关重要。

L-乳酸的制备工艺主要有化学合成法、酶法转化法和微生物发酵法。美国Monsanto公司首次开始利用化学合成法，使用乙醛与剧毒化合物氢氰酸在碱性催化剂作用下经多步反应合成乳酸。然而，该方法不但生产成本高、污染严重，而且安全性无法确定。乳酸酶法是以丙酮酸或2-氯丙酸为底物，经过乳酸脱氢酶或L-2-卤代酸脱卤酶催化后获得，专一性较高，但工艺要求严格且繁琐，在工业上没有广泛应用。微生物发酵法，原料来源除了能利用葡萄糖、乳糖等单糖外，还能以淀粉、纤维素等多糖发酵；正以成本低廉、产物安全性高等优点占据L-乳酸生产的重要位置。

在生产乳酸过程中，常常会面临因产物累积而导致的酸胁迫问题。有机酸会导致发酵细胞生长减慢，从而影响发酵过程的产率。工业水平的乳酸生产需要添加大量的中和剂，如CaCO3、NaOH和NH₄OH。这限制了乳酸的生物生产，因为它损害了沉淀乳酸盐的再生，并且涉及更高的成本。

目前，发酵生产L-乳酸常用的菌种为乳杆菌、米根霉、酿酒酵母等。乳杆菌具有较高的乳酸脱氢酶(LDH)活性，但发酵营养需求比较高、培养组分复杂、无法耐受低pH产物；米根霉营养要求低，但发酵过程中需要通气搅拌，副产物积累比较严重，成本比较高；酿酒酵母具有清晰的遗传背景。近年来，通过代谢工程手段将外源LDH引入酿酒酵母，辅以加强前体供给、途径改造等策略，使其具备了异源生产L-乳酸的能力；同时，酿酒酵母具有可耐受低pH这一特殊优势，使其成为大规模生产有机酸的优选菌株。

工业生产过程中，基于经济效益的考虑，生产商对有机酸产量要求较高，但在宿主细胞构建过程中，随着有机酸浓度的不断积累形成了低pH环境，对宿主细胞的生长有很大程度的抑制。目前报道的微生物生产短链有机酸主要是添加中和剂(CaCO₃)来调节发酵过程的低pH，生成的产物主要以有机酸盐的形式存在，后续要先经过酸解，才能进一步的分离、纯化。一方面增加了产物分离、纯化的成本和工序，另一方面如果前期添加的中和剂，或者后续酸解所用的酸反应不完全，还会造成资源的浪费和环境的污染。

为解决上述存在的低pH抑制宿主细胞生长，添加中和剂提高成本、增加后续分离和纯化工序、容易造成环境污染等问题。本实验室前期以酿酒酵母CEN.PK2-1C为出发菌株，连续定向进化筛选得到可以耐受pH 2.44的突变体MTPfo-4(申请号为202010631510.4)。以MTPfo-4作为生产菌株可以提升菌种对于有机酸产物的耐受性，但是目前突变体MTPfo-4的L-乳酸的产量还不够高，还不适用于工业生产。

发明内容