[发明专利]一种副干酪乳杆菌S-NB基因缺失突变株及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了一种副干酪乳杆菌S‑NB基因缺失突变株及其构建方法和应用，所述S‑NB基因缺失突变株以副干酪乳杆菌S‑NB为出发菌株，使所述副干酪乳杆菌S‑NB中的cps基因上游片段被敲除质粒携带的cps基因上游同源臂基因替换，副干酪乳杆菌S‑NB中的cps基因下游基因片段被敲除质粒携带的cps基因下游同源臂基因替换；其中，cps基因上游同源臂基因碱基序列如SEQ ID NO:1所示，cps基因下游同源臂基因碱基序列如SEQ ID NO:2所示。与传统方法相比，本发明中敲除载体构建的成功率达到95％以上，且操作简单，耗时短，操作周期仅为6‑7天；利用本发明构建的敲除载体敲除副干酪乳杆菌S‑NB的cps基因，所得cps基因缺失突变株生长不受影响，荚膜层变薄，产生物膜能力下降。

技术领域

本发明涉及一种副干酪乳杆菌S-NB基因缺失突变株及其构建方法和应用，属于分子生物技术领域。

背景技术

乳酸菌是公认安全的益生菌，在其发酵过程中不仅能赋予食品独特的质地及风味口感，也具备改善调节机体免疫力、改善人体肠道菌群等益生功能。副干酪乳杆菌作为一种革兰氏阳性菌，可作为益生菌应用于健康乳制品和保健品的研制。随着乳酸菌的功能特性和应用研究的深入，利用分子手段和遗传编辑工具探究乳酸菌的功能性基因，并对其进行改造以观察乳酸菌功能性的改变已成为近年来的研究热点。目前应用于乳酸菌基因改造的载体主要以条件型整合载体和带有反向筛选标记的整合载体为主。在构建基因编辑载体时，研究者通常使用传统的酶切酶连方法，但对于许多低拷贝质粒而言，酶切后回收效率低，且后续的连接过程耗时长，步骤繁琐；同时扩增片段存在模板残留以致在后续筛选阶段易出现假阳性，这些都成为乳酸菌基因改造的限制因素。另外，乳酸菌种属较多，不同种属间菌株差异性较大，针对不同宿主菌株需采用针对性的外源片段转化方法。因此，提供一种高效并广泛适用于副干酪乳杆菌属的敲除载体构建方法及转化方法，对于副干酪乳杆菌的遗传改造具有重要的应用价值。

乳酸菌在宿主肠道中持久发挥益生作用的前提是其必须黏附于宿主肠黏膜上皮细胞表面并能进一步定殖，在肠道中某个部位逐渐形成稳定的菌群。与黏附作用相关的主要是黏附素(磷壁酸、S-层蛋白、脂多糖、肽聚糖、胞外多糖等)的分泌和与黏附素受体结合。位于乳酸菌细胞结构最外层的胞外多糖(exopolysaccharide，EPS)被证明与黏附作用密切相关。EPS通常被分为两类：分泌到培养基中形成黏液的为黏液多糖(slimeexopolysaccharide，sps)；与细胞壁紧密结合在一起形成一层荚膜，通过简单离心不能获得则称为荚膜多糖(caspular exopolysaccharide，cps)。调控荚膜多糖合成的基因通常位于染色体或质粒上。因此，从分子水平了解副干酪乳杆菌荚膜多糖合成相关基因对其菌株形态、益生功能的影响机制显得尤为迫切。

发明内容

针对现有技术所存在的不足，本发明的第一个目的在于提供一种副干酪乳杆菌S-NB基因缺失突变株；本发明的第二个目的在于提供一种副干酪乳杆菌S-NB基因缺失突变株的构建方法；该方法可在6-7天内筛选得到目的基因缺失突变株，不含抗生素筛选标记；本发明的第三个目的是提供上述副干酪乳杆菌S-NB基因缺失突变株的应用。

本发明解决其技术问题采用的技术方案是：

一种副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)S-NB，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期：2021年5月4日，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M2021461。