[发明专利]一种基于纳米孔测序仪的8种疱疹病毒快速鉴定方法

说明书

本发明公开了一种基于纳米孔测序仪的8种疱疹病毒快速鉴定方法，分子生物检测领域，包括如下步骤：步骤一，提取8种疱疹病毒1型单纯疱疹病毒、2型单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、Epstein‑Barr病毒、水痘带状疱疹病毒、人类疱疹病毒6、人类疱疹病毒7及人类疱疹病毒8的宿主和病毒微生物基因组；步骤二，设计8种疱疹病毒检测靶标位点的特异性引物，进行第一轮多重PCR扩增；步骤三，使用Index接头引物对纯化产物进行第二轮多重PCR扩增；步骤四，将所有样本取相同质量进行pooling，末端修复加A尾，连接测序接头即完成文库构建；步骤五，文库质控合格后，进行纳米孔测序；本发明判断快速准确且高通量，为辅助疱疹的早期发现提供了技术基础。

技术领域

本发明涉及分子生物学检测领域，特别是一种基于纳米孔测序仪的8种疱疹病毒快速鉴定方法。

背景技术

疱疹病毒属于疱疹病毒(Herpesviridae)科，是一类有包膜、基因组为双链的DNA病毒。目前发现的能感染人的疱疹病毒有8种，在临床上引起了多种严重的人类疾病，如发热、黄疸、肝脾肿大、脑炎或脑膜炎等。

疱疹病毒感染者因症状和体征无特异性，其早期发现主要依赖于临床经验判断。传统的病毒分离培养、血清学诊断等技术因特异性和灵敏度较低，极易导致误诊和漏诊。实时定量PCR由于本身的技术限制或其它多方面因素，会导致大量“假阴性”出现，而且不能满足大量样本快速检测的需求。因此，临床上急需一种有效利用核酸检测手段来快速高效高通量且准确的辅助判断疱疹病毒感染的方法。

纳米孔测序是将人工合成的一种多聚合物的膜浸在离子溶液中，多聚合物膜上布满了经改造的穿膜孔的跨膜通道蛋白(纳米孔)，也就是Reader蛋白，在膜两侧施加不同的电压产生电压差，DNA链在马达蛋白的牵引下，解螺旋通过纳米孔蛋白，不同的碱基会形成特征性离子电流变化信号。该膜具有非常高的电阻。通过纳米孔的单分子引起特征性的电流干扰，这被称为Nanopore信号。

纳米孔是对穿过的片段进行测序，而不管DNA片段的长度如何。也不是生成特定长度的序列，这可能是数百个碱基、或者更多个碱基的序列。Nanopore的长序列简化了重复区域的组装和测序，也提高了物种鉴定和宏基因组实验的速度。

多重PCR技术可以在一个反应孔中完成多对引物的扩增，即通过一次PCR可完成多个靶标区域的富集，克服了普通PCR的缺点。但多重PCR技术应用在病毒微生物检测中容易出现假阳性结果。

市场需要一种能够快速准确判断8种疱疹病毒的方法，辅助疱疹的早期发现。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种基于纳米孔测序仪的8种疱疹病毒快速鉴定方法，本发明判断快速准确且高通量，为辅助疱疹的早期发现提供了技术基础。

为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种基于纳米孔测序仪的8种疱疹病毒快速鉴定方法，包括如下步骤：

步骤一，提取8种疱疹病毒的宿主和病毒微生物基因组；

8种疱疹病毒包括：1型单纯疱疹病毒(HSV-1)、2型单纯疱疹病毒(HSV-2)、巨细胞病毒(CMV)、Epstein-Barr病毒(EBV)、水痘带状疱疹病毒(VZV)、人类疱疹病毒6(HHV-6)、人类疱疹病毒7(HHV-7)及人类疱疹病毒8(HHV-8)；

步骤二，设计8种疱疹病毒检测靶标位点的特异性引物，在各正向引物的5’端加上接头序列AGGTCTTCACGATACGTCGAG，各反向引物的5’端加上接头序列GTCCAATCAGTTGCAGCTTCAG，使用含接头序列的特异性引物的混合物进行第一轮多重PCR扩增，对目的片段进行富集、纯化；