[发明专利]一种基于纳米孔测序仪的8种疱疹病毒快速鉴定方法

权利要求书

1.一种基于纳米孔测序仪的8种疱疹病毒快速检测引物在制备辅助疱疹早期发现产品中的应用，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一，提取8种疱疹病毒的宿主和病毒微生物基因组；

8种疱疹病毒包括：1型单纯疱疹病毒(HSV-1)、2型单纯疱疹病毒(HSV-2)、巨细胞病毒(CMV)、Epstein-Barr病毒(EBV)、水痘带状疱疹病毒(VZV)、人类疱疹病毒6(HHV-6)、人类疱疹病毒7(HHV-7)及人类疱疹病毒8(HHV-8)；

步骤二，设计8种疱疹病毒检测靶标位点的特异性引物，在各正向引物的5’端加上接头序列AGGTCTTCACGATACGTCGAG，各反向引物的5’端加上接头序列GTCCAATCAGTTGCAGCTTCAG，使用含接头序列的特异性引物的混合物进行第一轮多重PCR扩增，对目的片段进行富集、纯化；

所述8种疱疹病毒检测靶位点分别为HSV12的gB基因、CMV的IE基因、EBV的EBNA2基因、VZV的DNA poly基因、HHV-6的UL57基因、HHV-7的UL10基因及HHV-8的ORF26基因；

步骤三，使用Index接头引物对纯化产物进行第二轮多重PCR扩增、纯化、定量，在Index各正向引物3’端加上测序接头AGGTCTTCACGATACGTCGAG，在Index各反向引物3’端加上测序接头GTCCAATCAGTTGCAGCTTCAG，使每个样本加上不同Index，完成目标片段富集；

步骤四，将带有不同Index的二轮纯化产物质控合格后，所有样本取相同质量进行pooling,末端修复加A尾，连接测序接头即完成文库构建；

步骤五，文库质控合格后，进行纳米孔测序；

步骤二中含接头序列的特异性引物为：

2.根据权利要求1所述的一种基于纳米孔测序仪的8种疱疹病毒快速检测引物在制备辅助疱疹早期发现产品中的应用，其特征在于，

步骤一中提取8种疱疹病毒的宿主和病毒微生物基因组的具体内容包括：

1)将含有微生物的液体加入到离心管中作为样本；

2)在离心管中加入灭菌后的玻璃珠、蛋白酶K，震荡研磨；

3)吸取研磨后的液体，加入裂解液，放置；

4)在离心管中加入核酸助沉剂，漩涡混匀；

5)在离心管中加入磁珠，漩涡混匀，放置；

6)将离心管置于磁力架上，待磁珠完全聚集后，吸出上清液；

7)将第一洗涤液加入离心管中，静置，吸出上清液；

8)将第二洗涤液加入离心管中，静置，完全吸出上清液；

9)向离心管内加入洗脱液，漩涡混匀，放置；

10)将离心管置于磁力架上，待磁珠完全聚集后，吸出上清液至另一新的离心管内，即得到纯化的DNA。

3.根据权利要求1所述的一种基于纳米孔测序仪的8种疱疹病毒快速检测引物在制备辅助疱疹早期发现产品中的应用，其特征在于，所述第一轮多重PCR扩增的扩增体系为：

；

扩增程序为：95℃预变性3分钟，循环内95℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，20个循环；循环结束后72℃延伸5分钟；4℃保存。

4.根据权利要求1所述的一种基于纳米孔测序仪的8种疱疹病毒快速检测引物在制备辅助疱疹早期发现产品中的应用，其特征在于，

所述第二轮多重PCR扩增的扩增体系为：

；

扩增程序为：补充第二轮多重PCR扩增的程序。

5.根据权利要求1所述的一种基于纳米孔测序仪的8种疱疹病毒快速检测引物在制备辅助疱疹早期发现产品中的应用，其特征在于，所述纯化采用的方法是磁珠纯化。

6.根据权利要求1所述的一种基于纳米孔测序仪的8种疱疹病毒快速检测引物在制备辅助疱疹早期发现产品中的应用，其特征在于，

第一轮多重PCR扩增后纯化一次，第二轮多重PCR扩增后纯化二次。