[发明专利]一组检测核酸的HCR-DNAzyme探针及其应用

说明书

本发明属于分子生物学技术领域，公开了一组检测核酸的HCR‑DNAzyme探针及其应用。该探针，包含探针H1、探针H2和底物链H3。该HCR‑DNAzyme探针可以特异性识别目标核酸，实现基于DNAzyme辅助的杂交链反应(HCR)的指数级信号放大，反应动力学提高，检测限降低，仅为3.28fM，相比传统的HCR探针检测限降低了5个数量级(传统的HCR探针的检测限为0.78nM)，同时，检测灵敏度比传统的DNAzyme探针提高了5个数量级，即本发明提供的HCR‑DNAzyme探针灵敏度高、检测限低、特异性强；并且具有更优的反应动力学。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一组检测核酸的HCR-DNAzyme探针及其应用。

背景技术

MicroRNA(miRNA)是一类短的非编码RNA(长度为18～23个碱基)，是细胞发育过程中许多生物学过程的核心因素之一。miRNA在许多必不可少的细胞过程(包括细胞增殖，迁移和凋亡)中发挥关键作用；其异常表达水平与恶性肿瘤的发生，转移和进展有关。大量研究表明，microRNA是一类稳定的肿瘤标志物，对microRNA进行检测有助于了解肿瘤的发展状况或用于疾病诊断。microRNA具有序列相似度高、丰度低的特点，开发高选择性高灵敏度的microRNA检测方法是一个大的挑战。RT-qPCR是目前miRNA检测的金标准，灵敏度高。然而，RT-qPCR对热循环温度控制的高度依赖，对仪器的高要求以及复杂的样品制备，使其在临床上的应用受到了极大的限制。同时，该方法仅能够检测组织或细胞等样品RNA提取物中microRNA的平均含量，无法获得microRNA的空间信息。活细胞内microRNA的原位成像检测能够获取microRNA在活细胞内的表达水平和空间信息，是研究的热点和难点。

近来，恒温核酸扩增技术由于其反应条件温和，在恒温条件下即可实现高效扩增，被认为是实现活细胞内高灵敏核酸检测的有效方法。恒温核酸扩增技术主要分为基于生物酶的恒温扩增技术和无生物酶参与的恒温核酸扩增技术。生物酶难以转染进活细胞，然而核酸探针在一些纳米载体如金纳米粒子、石墨烯、二氧化锰等作用下能被有效转运进活细胞，无生物酶参与的扩增反应被逐渐用于活细胞内miRNA的成像分析。无生物酶参与的恒温扩增技术主要有催化发夹自组装反应(CHA)、杂交链反应(HCR)或基于功能核酸酶DNAzyme的信号放大方法。CHA是一种不依赖酶的链取代催化级联反应，在此系统中，目标序列可充当触发剂和催化剂，不断诱导探针之间的组装，实现信号的增强。杂交链反应(hybridization chain reaction(HCR))技术是由Dirks和Pierce等建立起来的一种基于DNA链取代反应的等温信号放大技术。在HCR体系中，靶分子引发两种DNA发夹结构的茎环交替开环，自组装形成包含大量重复单元的线性双链DNA纳米结构，放大效率达10⁴～10⁶倍。DNAzyme是近年来利用体外分子进化技术筛选得到的一种具有RNA裂解活性的DNA分子，具有核酸酶活性、过氧化物酶活性等多种催化功能及高效性和高特异性，金属辅助的脱氧核酶催化剂(DNAzymes)是用于在金属离子存在下裂解特定底物的基于DNA的催化剂，被广泛用于构建“一对多”信号扩增策略。尽管上述方法广泛用于活细胞内miRNA的分析，然而这些方法均为线性扩增，扩增效率有限，仅能检测细胞内含量低至pM水平的miRNA。然而，细胞内部分miRNA的含量低至aM水平，因此开发更高扩增效率的信号放大策略实现细胞内miRNA的高灵敏分析仍然是一大挑战。

发明内容

本发明第一方面的目的，在于提供一组检测核酸的HCR-DNAzyme探针。

本发明第二方面的目的，在于提供一种检测核酸的纳米片。

本发明第三方面的目的，在于提供一种检测核酸的纳米片的制备方法。

本发明第四方面的目的，在于提供一种检测核酸的试剂盒。

本发明第五方面的目的，在于提供本发明第一方面的HCR-DNAzyme探针、本发明第二方面的纳米片、或第四方面的试剂盒在非疾病诊断用途的核酸检测中的应用。