[发明专利]一种基于酵母细胞表面展示技术的爆炸物可视化生物传感器及其制备方法和应用

说明书

本发明提供了一种基于酵母细胞表面展示技术的爆炸物可视化生物传感器及其制备方法和应用。所述爆炸物可视化生物传感器中含有锚定蛋白的编码基因和爆炸物可视化的目标基因dntA或dntB基因。本发明利用锚定蛋白将目标基因表达产物锚定到宿主菌表面，最终获得爆炸物可视化生物传感器。该生物传感器能够特异性的将2,4‑二硝基甲苯（2,4‑DNT）降解成一种肉眼可见的红色物质2‑羟基‑5‑甲基苯醌，进而判断待测样品中是否存在爆炸物分子，并且其在420nm处具有最大吸光值，可根据标准曲线计算2,4‑DNT浓度，其稳定性很好，且检测范围宽、灵敏度高、方法简便、成本低、安全性强，因此具有广泛的应用前景。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说是一种基于酵母细胞表面展示技术的爆炸物可视化生物传感器及其制备方法和应用。

背景技术

微生物细胞表面展示技术是利用锚定蛋白的作用将目标肽或蛋白质在展示在噬菌体、细菌和酵母细胞的表面。与从细胞质中纯化肽或蛋白质酶，微生物细胞表面展示有三个优势。首先，目标蛋白可以在锚蛋白的作用下锚定在宿主细胞的外膜上，因此展示的蛋白能够直接接触细胞外界环境种的底物，从而加快蛋白与底物的反应。其次，通过使用细胞膜作为基质，蛋白质的稳定性提高。第三，只需收获细胞即可获得蛋白质，无需冗长繁琐的纯化过程。到目前为止，该方法已广泛应用于疫苗筛选、环境修复、全细胞催化、生物传感器等领域。在生物传感器方面，已经开发了各种检测模式和系统，具有优异的灵敏度、特异性和稳定性，包括基于细菌或酵母表面展示系统的电化学和光谱学检测中。

生物传感技术是利用基因工程手段对菌株进行改造，使得该微生物在感应特定化合物或者特定化合物在微生物中的代谢产物后，微生物发生可以被检测的变化，从而达到对特定化合物进行检测的目的。这种生物传感器主要由感应元件和报告元件两部分构成，其中感应元件可特异性地感应靶标化合物，感应元件是负责基因转录的启动子、核糖体结合位点、终止子、转录调控因子等等；而报告元件可在感应元件的作用下而产生感应信号，一般常用的报告元件包括绿色荧光蛋白（GFP）、黄色荧光蛋白（YFP）、红色荧光蛋白（RFP）和荧光素酶，分别产生绿色荧光、黄色荧光、红色荧光和自发光等可以被检测的感应信号。这些较为常见的报告元件的特点是技术成熟、容易操作，但是荧光和自发光的检测需要借助于分析仪器，例如酶标仪、紫外分析仪、荧光检测仪、自发光检测仪等，还需要对荧光信号和自发光信号进行定量和定性分析。荧光和自发光均不能实现肉眼观察，尤其是在由外界光照的情况下。

战区残留爆炸物（例如地雷）对于生命安全、生态系统都造成了不可修复的损伤，因此针对地雷进行安全有效的检测具有重要的战略意义。通过生物传感技术对残留地雷进行检测是一种有效的手段。爆炸物（例如地雷）的有效成份为为2,4,6-三硝基甲苯（TNT），TNT可自然分解为多种化合物，如1,3-二硝基苯（1,3-DNB）和2,4-二硝基甲苯（2,4-DNT），其中2,4-DNT的稳定性最高，可在自然环境中长期存在。以色列科学家Shimshon Belkin报道了对爆炸物分子2,4-DNT的感应元件，即yqjF启动子，利用GFP作为报告元件，构建了检测2,4-DNT的生物感应系统，检测限达到0.01 mg/L（New Biotechnology, 2020, 59, 65-73），处于国际上领先水平。此生物感应系统需使用仪器进行特定波长的紫外激发，以及绿色荧光信号的收集。另外，多种非GFP物质都能在紫外激发下发出绿色荧光，从而产生干扰信号。因此，该传感器的特异性较差，大大限制了其在复杂环境中的应用。

但到目前为止，国内外无利用表面展示来进行爆炸物分子可视化检测的相关报道。

发明内容

为了实现爆炸物分子的可视化检测，本发明提供了一种一种基于酵母细胞表面展示技术的爆炸物可视化生物传感器及其制备方法和应用。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：