[发明专利]一种宏基因组绝对定量的检测方法及其应用

说明书

本发明提供了一种宏基因组绝对定量的检测方法及其应用。所述检测方法中在待测样本DNA中加入微生物绝对定量用参照DNA，经过两轮扩增之后，使用测序平台测序和基因组序列比对，实现所述待检测样本中微生物含量的绝对定量。所述检测方法能够快速建立原核生物，真核生物和真菌检测体系，降低检测成本，且灵敏度较高，是一种准确、可靠的能对单位质量样本中的微生物的含量进行绝对定量方法。

技术领域

本发明涉及生物信息学和分子生物学检测领域，具体涉及一种宏基因组绝对定量的检测方法及其应用，尤其涉及一种微生物绝对定量用参照DNA、宏基因组绝对定量的检测方法及其应用。

背景技术

微生物组(microbiota)影响人类和动物的疾病和免疫、地球化学养分循环和植物生产力等多个方面。研究人员通过PCR扩增特定的组，包括细菌，古细菌，真核生物或真菌，以评估亚组(例如属)的相对丰度。然而，这既没有揭示亚组的绝对丰度，也没有比较不同的扩增子家族(即衍生自一对特定的PCR引物，例如细菌16S、真核生物18S或真菌ITS的OTUs)。这就阻碍了对特定群体绝对丰度的测定，而且微生物群落丰度的域水平的变化可能无法被检测到。

在过去的十年里，扩增子DNA测序显示，微生物群影响着人类的免疫、消化、心理健康以及植物的生长发育。这些在不同领域的研究揭示了不同微生物群之间的微妙关系，就植物而言，突出了土壤微生物群落对植物健康的重要性。环境微生物群落具有丰富的多种组成成分，通常通过标记基因的PCR扩增进行研究。然而，在大多数研究中，只研究了一个微生物组中某一类别(域)，如细菌。此外，大多数微生物组研究受到使用域特异性引物产生的PCR扩增子(来自单个环境样品的扩增基因)的限制，进而导致任何两组或两组以上PCR扩增子之间的定量比较丢失。

然而，为了揭示肠道、土壤和其他环境的真正复杂性，必须确定主要微生物群之间的数量关系。目前，16s和宏基因组测序研究中，菌群的数量和结构主要通过相对丰度来表示，然而基于相对值的菌群分析方法局限性较大。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种宏基因组绝对定量的检测方法及其应用。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种微生物绝对定量用参照DNA的制备方法，所述制备方法包括：

以人源基因组DNA为模板，以携带微生物结合位点的扩增引物对进行扩增、纯化，得到所述微生物绝对定量用参照DNA。

本发明设计了短的嵌合合成DNA片段，其中包含对三个主要微生物区域(原核生物、真核生物和真菌)具有特异性的通用引物结合位点。因此，所述扩增引物对包括原核参照引物对、真核参照引物对和真菌参照引物对，其中，各条引物的长度为37～46bp(例如可以是37bp、38bp、39bp、40bp、41bp、42bp、43bp、44bp、45bp或46bp等)，GC含量为40～60％(例如可以是40％、42％、44％、45％、46％、48％、50％、52％、55％、56％、57％、58％或60％等)。

所述携带微生物结合位点的扩增引物对为微生物参照引物对，其序列包括如SEQID NO.1～SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列。

SEQ ID NO.1：

CCTACGGGNGGCWGCAGGCAACTACAAGAGGCTGAATGC

SEQ ID NO.2：

GACTACHVGGGTATCTAATCCGGAGAAATGAGAGGCCTGATG

SEQ ID NO.3：

AGTTAAAAAGCTCGTAGTTGAAAGCCCAGCACCTCTCACC

SEQ ID NO.4：