[发明专利]用于无精子症和严重少精子症检测的特异性标志物筛选方法

权利要求书

1.一种用于无精子症和严重少精子症检测的特异性标志物筛选方法，其特征在于，所述用于无精子症和严重少精子症检测的特异性标志物筛选方法包括：

利用microRNAs芯片、蛋白组和代谢组三种高通量技术筛选严重少精症、无精症特异性标志物，借助real-time PCR和ELISA技术获得real-time试剂盒和ELISA快速诊断试剂盒。

2.一种real-time试剂盒和ELISA快速诊断试剂盒，其特征在于，所述real-time试剂盒和ELISA快速诊断试剂盒包含权利要求1所述筛选方法中的特异性标志物。

3.一种如权利要求2所述real-time试剂盒和ELISA快速诊断试剂盒的构建方法，其特征在于，所述real-time试剂盒和ELISA快速诊断试剂盒的构建方法包括：

步骤一，对样品进行收集，并对样品进行处理，筛选出严重少精症、无精症的特异性标志物；

步骤二，睾丸组织层面，利用芯片方法筛选正常男性和不育男性睾丸组织中差异microRNA的表达；精浆层面，用蛋白组学方法寻找正常男性和不育男性的差异标记蛋白；尿液层面，利用代谢组学，筛选正常男性和不育男性尿液中代谢产物的差异；

步骤三，整合从睾丸组织层面、精浆层面和尿液层面三个高通量层面获得数据，将这些数据进行与精子质量、密度、活力之间的关联分析；

步骤四，构建诊断技术优化中的eal-time试剂盒和ELISA快速诊断试剂盒。

4.如权利要求3所述real-time试剂盒和ELISA快速诊断试剂盒的构建方法，其特征在于，所述步骤一中，样品收集具体包括：

检测血尿常规、精液常规及血激素水平；分别收集其血液、精浆、尿液样本，采集样本组织，液氮保存。

5.如权利要求3所述real-time试剂盒和ELISA快速诊断试剂盒的构建方法，其特征在于，所述步骤一中，样品处理包括：精浆处理、尿液处理、睾丸组织处理。

6.如权利要求5所述real-time试剂盒和ELISA快速诊断试剂盒的构建方法，其特征在于，所述精浆处理具体包括：

首先提取精浆中总蛋白，用蛋白组学方法获取不同类型精浆中的差异蛋白；蛋白的相对表达量用扫描积分光密度值表示，两组间量升高或者降低2倍者定义为差异点，每个样品均重复5次；选取凝胶上分析的差异蛋白质点，同时选一阴性点空白胶作为对照；

将切下的胶点放入加有微量水的离心管中，进行HDMS鉴定；最后，用westernblotting方法对差异蛋白进行验证。

7.如权利要求5所述real-time试剂盒和ELISA快速诊断试剂盒的构建方法，其特征在于，所述尿液处理具体过程为：

将收集的尿液进行适当离心，去除杂质；然后用代谢组学方法检测不同群体患者尿液中的代谢产物差异。

8.如权利要5所述real-time试剂盒和ELISA快速诊断试剂盒的构建方法，其特征在于，所述睾丸组织处理包括：

将采集的睾丸组织从RNA保护液中取出，然后用RNA提取试剂盒提取总RNAs；在保证RNA质量的条件下，利用miRCURY LNA expression array方法进行差异microRNA的鉴定；最后用real-time PCR方法进一步验证差异microRNA的表达。

9.如权利要求4所述real-time试剂盒和ELISA快速诊断试剂盒的构建方法，其特征在于，所述步骤四包括：根据差异microRNA的表达水平，利用real-time PCR平台构建real-time试剂盒；利用精浆中差异蛋白水平或尿液中代谢产物的差异构建ELISA快速诊断试剂盒。

10.一种应用权利要求1所述筛选方法筛选的特异性标志物在制备检测无精子症和严重少精子症药物上的用途。