[发明专利]构建Tp53基因敲除金黄叙利亚仓鼠模型的方法和应用

说明书

本发明提供构建Tp53基因敲除金黄叙利亚仓鼠模型的方法和应用，涉及疾病动物模型及其制备技术领域，所述方法包括：设计仓鼠Tp53基因特异性打靶序列、制备Tp53的打靶质粒载体pX330‑sgRNA、将pX330‑sgRNA显微注射至仓鼠受精卵的细胞核中、然后移植入受体母仓鼠内，F0代仓鼠出生，经鉴定该方法成功构建了Tp53基因敲除金黄叙利亚仓鼠模型。本发明阐述了第一个敲除Tp53基因的金黄叙利亚仓鼠的癌症表型，与Tp53突变的人类癌症类似，在Tp53^‑/‑仓鼠模型发现多种类型的肉瘤，包括血管肉瘤、骨肉瘤，及低频癌，组织包括肾、胰腺和肾上腺。采用本发明所述方法制备的仓鼠模型能够补充当前小鼠模型，有利于研究Tp53缺乏症导致的人类癌症是如何发生发展，并为新型疗法的研究提供有效动物模型。

技术领域

本发明涉及疾病动物模型及其制备技术领域，具体地，涉及一种癌症动物模型的构建方法和应用，尤其是构建Tp53基因敲除金黄叙利亚仓鼠模型的方法和应用。

背景技术

编码p53蛋白的Tp53肿瘤抑制基因是人类癌症中最常见的突变基因，在人类癌症中发生中约占50％以上，其中包括所有主要组织的癌变，但在其他类型癌症中该基因活性被抑制，因此，p53被称为“基因组的守护者”。继承突变Tp53等位基因的人类会患利弗劳梅尼综合征(Li-Fraumeni Syndrome，LFS)，其特征是一系列早发性癌症，包括绝经前乳腺癌、软组织和骨肉瘤、肺癌、胰腺癌、皮肤癌和肾上腺皮质癌，部分脑肿瘤和白血病等。大多数Tp53突变是功能丧失(LOF)或显性负功能增益(GOF)错义突变，主要集中在外显子4-9，包括p53蛋白的DNA结合域，这些错义突变与癌细胞运动、侵袭和转移有关，Tp53突变是癌细胞侵袭性的重要预后预测因子，并且其与较差的临床结果相关。另有研究报道，p53基因的低表达或缺失可能影响动脉粥样硬化的发生。

目前已经建立了多种p53(其基因在小鼠中称为Trp53)缺陷的小鼠模型，上世纪九十年代初，为了模拟最初LSF小鼠模型，Donehower等人和Jacks等人建立了两个纯合敲除(KO)模型(Trp53^-/-模型)，研究发现Trp53^-/-LFS小鼠在大约4个月大时死于胸腺T细胞淋巴瘤，同时低频率发生B细胞淋巴瘤和肉瘤，尤其是血管肉瘤。值得注意的是，早期的LFS小鼠模型(包括Trp53^-/-模型和Trp53^+/-模型)并没有概况在人类LFS患者中观察到的肿瘤的谱图、频率或潜伏期。癌症在Trp53^-/-LFS小鼠模型中非常罕见。Olive等人建立LFS杂合的LOF错义突变和GOF点突变小鼠模型，如结构突变体Trp53^R172H和DNA接触突变体Trp53^R270H。这些小鼠发生多种癌症，使其更接近于人类LFS患者中发现的癌症。然而，目前已经建立的Trp53突变小鼠模型并没有完全概括在人类LFS患者中观察到的所有癌症，这些表现差异可能是由于物种和小鼠品系差异造成的。金黄叙利亚仓鼠是常用的实验小动物，与小鼠相比体型更大，且生理学特征与人类更相似，是研究人类疾病相关基础和药物开发的常用动物模型。与大、小鼠相比，金黄叙利亚仓鼠更适合代谢性疾病、癌症、心血管疾病和感染性疾病等研究。尤其在肿瘤方面的研究，金黄叙利亚仓鼠解剖学、生理学和病理学更接近人类，其荷载肿瘤时间长且肿瘤生长体积更大。但是由于金黄叙利亚仓鼠基因组序列不完全、胚胎干细胞培养不成熟导致利用传统方法制备基因敲除金黄叙利亚仓鼠困难，极少有关于叙利亚仓鼠肿瘤模型开发的研究报道。

发明专利CN108690839A虽然公开了一种以SD大鼠为背景的Tp53基因敲除大鼠模型的构建方法，但是其解决的是现有技术中对p53基因敲除大鼠模型制备过程中存在的成本高、制备周期长、背景不纯的技术问题，针对该方法制备出的大鼠模型的癌症表型并未说明。因此，构建新的Tp53敲除动物模型对研究有关Tp53缺乏症导致人类癌症的发病机制及其成为测试新型疗法的新模型具有重要的临床意义。

发明内容

(一)解决的技术问题