[发明专利]构建Tp53基因敲除金黄叙利亚仓鼠模型的方法和应用

权利要求书

1.构建Tp53基因敲除金黄叙利亚仓鼠模型的方法，其特征在于，所述方法利用CRISPR/Cas9技术建立Tp53基因敲除的金黄叙利亚仓鼠，敲除序列如SEQ ID NO:1所示；所述方法包括以下步骤：

(1)设计仓鼠Tp53基因特异性打靶序列，选择第5外显子上序列作为CRISPR作用的靶点设计sgRNA，所述sgRNA序列如SEQ ID NO:2所示；

(2)利用pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9质粒(以下简称pX330质粒)获得Tp53的打靶质粒载体pX330-sgRNA，所述pX330质粒购自Addgene公司，Addgene编号：42230；

(3)将所述步骤(2)制备得到的pX330-sgRNA注射至仓鼠受精卵细胞核中，然后移植入受体母仓鼠内，F0代仓鼠出生，鉴定。

2.根据权利要求1所述的构建Tp53基因敲除金黄叙利亚仓鼠模型的方法，其特征在于，所述pX330-sgRNA按照以下步骤制备得到：用Bbs I限制性内切酶，酶切pX330质粒。将Bbs I酶和pX330质粒放在37℃水浴锅中酶切2小时，65℃酶失活15min，用1％琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，回收线性化pX330质粒；将退火后的Oligo sgRNA通过T4连接酶室温1.5h连接线性化pX330质粒；将2μL的连接溶液加入DH5α感受态细胞转化均匀涂LB培养板9，37℃孵育12-16h；挑取上述步骤单克隆放入相同抗性LB培养液，37℃摇床孵育12-16h；利用GeneJETPlasmid Miniprep Kit进行质粒提取，提取质粒测序鉴定，所用测序引物序列为SEQ IDNO:3；将测序正确的质粒，进行过夜扩大培养。利用QIAGEN EndoFree Plasmid Kit进行质粒抽提，抽提DNA质粒加入无内毒素TE溶液。

3.根据权利要求1所述的构建Tp53基因敲除金黄叙利亚仓鼠模型的方法，其特征在于，用于鉴定F0代基因型使用的引物为：上游引物如序列SEQ ID NO:4所示，下游引物如序列SEQ ID NO:5所示，PCR反应产物琼脂糖凝胶电泳检测特异的目的条带后送Sanger测序，对色谱峰图和序列分析确定突变的位置。

4.如权利要求1至权利要求3任一项所述的构建Tp53基因敲除金黄叙利亚仓鼠模型的方法，其特征在于，所述方法应用于制备癌症领域研究的动物模型。