[发明专利]一种基于恒温扩增的比色核酸检测试剂盒和检测方法

说明书

本发明提供一种基于恒温扩增的比色核酸检测试剂盒和检测方法，基于恒温扩增的快速反应，比色读取结果。该试剂盒包括如下组分：LAMP比色缓冲液、dNTPs、Bst2.0DNA聚合酶和逆转录酶。本试剂盒采用LAMP恒温扩增技术，应用于不同核酸的检测只需改变LAMP扩增引物的设计。本发明实现了将核酸特异性扩增反应的结果转化为人眼可观察的颜色变化，具有快速检测、特异性强、灵敏度高、可视化等特点。

技术领域

本发明涉及核酸检测技术和分子诊断等领域，具体地，是一种基于恒温扩增的快速可视化核酸检测试剂盒和检测方法。

背景技术

随着新冠疫情的流行，世界各地核酸检测量剧增。传统的核酸检测方法是采用PCR扩增技术，扩增目标核酸，读取荧光信号。由于需要升降温的循环，PCR扩增流程繁琐、耗时长。同时，升降温的控制对检测设备提出了更高要求，而荧光信号的读取引入了较为复杂的光路。因此，利用PCR技术进行核酸检测往往设备笨重、便携性差，难以满足现场快速检测的需求。要满足病毒及病原菌核酸的快速便携检测需求，仍需要探索更为简便的检测方法。

LAMP是一种等温扩增技术，在固定温度下即可完成核酸扩增反应，对温控的要求大大降低。另外，LAMP采用2～3对特异性引物，只有这些引物都与待测核酸匹配才能启动扩增反应，大大提高了扩增的特异性。基于以上原因，LAMP越来越多地被用在核酸检测领域。在这些应用中，主流的核酸检测方法仍然是加入荧光染料与DNA双链结合。由于DNA扩增后荧光加强，因此可以根据荧光强度的变化判断是否存在目标DNA。

发明内容

本发明主要目的在于提供了一种恒温扩增的比色核酸检测试剂盒和检测方法，将核酸检测的结果转化为人眼可直接观察的溶液颜色变化。

本发明的目的通过以下技术方案来实现：

一种基于恒温扩增的比色核酸检测试剂盒，包含LAMP比色缓冲液、dNTPs、Bst2.0DNA聚合酶和逆转录酶。

优选的，所述LAMP比色缓冲液包括20mM(NH₄)₂SO₄、100mMKCl、16mMMgSO₄、0.2％Tween-20、1mMKOH和5mM酚红染料。

优选的，所述dNTPs包括dATP、dGTP、dCTP、dTTP各5mM。

优选的，所述Bst2.0 DNA聚合酶浓度等于或大于8U/μL。

优选的，所述逆转录酶浓度为8U/μL，当核酸检测对象为RNA时额外加入使用。

一种基于恒温扩增的比色核酸检测方法，使用所述基于恒温扩增的比色核酸检测试剂盒，利用环介导等温扩增技术(LAMP)特异性扩增目标核酸，再利用pH敏感染料将核酸扩增引起的pH变化转化为溶液由红到黄颜色的改变。

优选的，所述核酸检测方法的反应体系如下：

优选的，所述LAMP扩增引物可根据需检测的核酸自行设计，其中各引物浓度如下：

FIP/BIP primers 16mM

F3/B3 primers 2mM

Loop F/B primers 4mM。

所述逆转录酶只在待测样本是RNA时加入。

所述核酸检测方法包括如下步骤：

(1)依次将12.5μLLAMP比色缓冲液、7μLdNTPs、2.5μL根据目标核酸设计的LAMP扩增引物加入反应管；