[发明专利]基于RPA-侧流层析技术检测转基因玉米MON810的引物组和方法

说明书

本发明涉及基因检测领域，具体涉及一种基于RPA‑侧流层析技术检测转基因玉米MON810的引物组和方法。本发明所提供的引物组具有良好的特异性，即使在所提基因组的产量和纯度有所损失的情况下，也能通过RPA反应很好地实现对目标基因的扩增，进而有利于减少实际检测时的提取工序和提取时间，提升对转基因玉米MON810的检测效率。本发明极大地缩短了检测转基因玉米MON810时所需的时间，且不需要大型仪器设备，操作简便，有利于在实际检测中进行推广应用。同时，本发明方法的灵敏度较高，可检测MON810含量在0.1wt％以上的转基因玉米，符合国家标准的要求。

技术领域

本发明涉及基因检测领域，具体涉及一种基于RPA-侧流层析技术检测转基因玉米MON810的引物组和方法。

背景技术

MON810品系转基因玉米可用于饲料食品的加工原料，其外源基因来源于苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种HD-1菌种(Bacillus thuringiensis subsp.Kurstaki HD-1)的Cry1Ab基因，经基因修饰后接入质粒载体PV-ZMBK07中，通过基因枪法实现遗传转化。MON810转化事件的插入序列包含CaMV 35S启动子(299bp)、经修饰的抗虫基因Cry1Ab部分编码区域(2448bp)、玉米热激蛋白基因hsp70的内含子(804bp)。MON810表达的杀虫蛋白是苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)的杀虫晶体蛋白Cry1Ab，是所有抗虫蛋白中应用最广泛的一种，对欧洲玉米螟、西南玉米螟和亚洲玉米螟等鳞翅目害虫都具有良好抗性，对人类、哺乳动物和其它有益昆虫没有影响。Cry1Ab蛋白的杀虫机制是：该蛋白被昆虫摄入后，在碱性肠道中被活化，专一性与中肠上皮细胞受体结合，形成离子通道或孔洞，引起渗透压失衡，导致昆虫死亡。由于MON810品系在防治玉米螟方面的效果较好，自商业化至今，其种植范围越来越广，但是其食用安全和环境安全问题也越来越受到重视，因此对转基因MON810品系的分析检测至关重要。

目前针对MON810品系检测的国家标准是定性PCR法，出入境检测检疫行业标准是采用LAMP方法进行检测。这些方法从提取基因组到后续的扩增检测所需的时间都较长，且需要一些专业的仪器设备。

同时，传统的提取玉米基因组的方法是CTAB法，耗时大约3h。目前利用市面上的各种试剂盒提取玉米DNA也大约需要1-2h，在提取玉米基因组阶段所耗费的时间也比较长。

重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase polymerase amplification，RPA)是在多酶体系下进行的一种恒温体外扩增技术。RPA反应一般在20min左右即可完成，且灵敏度高，特异性强，所需仪器设备简单便携，尤其是2014年RPA商业化试剂盒问世，使得RPA操作更加简便，可满足现场检测的需求。但是由于RPA反应体系组分较复杂，可能会对凝胶成像结果造成一定的影响。

发明内容

(一)要解决的技术问题

为了开发一种快速、便携、灵敏且特异性强的检测转基因玉米MON810的方法，本发明提供了一种基于RPA-侧流层析技术检测转基因玉米MON810的引物组和方法。

(二)技术方案

本发明首先提供一种基于RPA-侧流层析技术检测转基因玉米MON810的引物组，其包括以下引物组中的一组或多组：

引物组I：

正向引物序列为：5’-TACAACGCCAAGCACGAGAC-3’(SEQ ID No.9)；

反向引物序列为：5’-ATCTGCTGCAGGTGGTCTTAC-3’(SEQ ID No.10)；

引物组II：

正向引物序列为：5’-GCTCAAGGCTTACACTCGCT-3’(SEQ ID No.5)；