[发明专利]基于PMA高通量测序和PICRUSt的抗生素抗性基因及潜在宿主细菌的鉴定方法

说明书

本发明提供了一种基于PMA高通量测序和PICRUSt的抗生素抗性基因及其潜在宿主细胞的鉴定方法，属于环境样品中新兴基因型污染物及其宿主细菌的鉴定技术领域。该方法包括如下步骤：一.针对环境样品使用PMA‑高通量测序技术，获取活微生物的物种注释信息；二.使用PICRUSt功能预测软件结合ARGs的KOs数据集鉴定ARGs；三.ARGs潜在活性宿主细菌鉴定，相较于以宏基因组测序为主的ARGs检测，有效的降低了ARGs的检测成本，提高了检测的全面性；最终实现了ARGs鉴定并溯源了ARGs的活性宿主细菌。本发明为解决在现有新兴基因型污染物在环境样品中检测费用较高，检测不全面以及活性宿主细菌的鉴定问题提供了方法。

技术领域

本发明属于环境样品中新兴基因型污染物及其宿主细菌的鉴定技术领域，具体涉及一种环境样品中抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes，ARGs)及其潜在活性宿主细菌的鉴定方法。

背景技术

抗生素被广泛应用于人类或动植物疾病预防/治疗及动物养殖中，中国是世界上生产和消耗抗生素最多的国家之一。抗生素在生物体内的代谢率较低(10％～40％)，绝大多数会以原药或代谢产物的形式通过粪便/尿液排出体外，对环境和人体健康构成了巨大的潜在危害。由抗生素诱导的细菌抗药性等问题已经引起社会各界的广泛重视，其中抗生素抗性基因(Antibiotic Resistance Genes，ARGs)已经成为当下研究的热点。

ARGs是一种新型的基因污染物，其比传统的化学污染更加难以研究和控制，且可在环境中持续残留、菌群间迁移、转化和传播对生态环境的危害极大。世界卫生组织(WHO)已将ARGs作为21世纪威胁人类健康的最重大挑战之一。ARGs在各个环境介质中广泛分布，如活性污泥、土壤、生物膜、水体、沉积物、空气介质等，且可以在微生物菌属之间实现垂直传播或水平转移，并且携带ARGs的宿主细菌(多重耐药性细菌)可以同时抵抗多种抗生素，它们的传播和扩散可能导致更广泛的疾病和感染。因此，ARGs在各种环境中的赋存特征、传播及削减等研究已成为环境污染控制领域研究的热点问题。

实时荧光定量PCR(qPCR)、高通量qPCR(HT-qPCR)和宏基因组测序是研究不同环境样品中ARGs赋存特征的常用方法。但均具有一些不足：

(1)qPCR费时、费力且需要特定的质粒标准品(需要一系列繁杂的分子生物学过程获得)，往往限制了其在定量所有ARGs方面的使用；

(2)HT-qPCR在通量方面比qPCR有大幅的提升，但是依旧依赖于已知的ARGs引物，在探索环境中未知ARGs方面有一定不足。

(3)利用宏基因组测序结合抗性基因数据库(ARDB和CARD)对ARGs进行比对注释，可以较全面的获得ARGs的丰度数据信息。但是，宏基因组测序价格昂贵，如想获取大尺度时间和空间范围内环境样品中ARGs的赋存特征将花费大量的经费。

因此，需要开发一种可以全面且经济的鉴定环境样品中ARGs分布特征的方法。虽然可以通过基于高通量测序的功能预测软件(如PICRUSt，phylogenetic investigationof communities by reconstruction of unobserved states)可以获得基因注释信息。但是前人研究主要基于基因组DNA，获得的是“死-活”微生物的群落数据，而活性微生物在ARGs的传播方便具有重要作用。因此，非常有必要挖掘ARGs的活性宿主细菌。叠氮溴化丙锭(propidium monoazide，PMA)是一种具有高亲和力的光敏反应DNA结合染料，可选择性与胞内DNA发生交联反应，将其与分子生物学手段相结合，可有效的抑制死菌的DNA扩增信号，从而实现活微生物的检测。综上，提出“基于PMA高通量测序技术结合PICRUSt”的方法可以实现全面、低成本的ARGs信息及其活性宿主细菌的鉴定，使我们对环境中ARGs的污染和传播有更深入和系统的理解，为其控制和削减提供依据。

发明内容