[发明专利]基于PMA高通量测序和PICRUSt的抗生素抗性基因及潜在宿主细菌的鉴定方法

权利要求书

1.基于PMA高通量测序和PICRUSt的抗生素抗性基因及潜在宿主细菌的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)环境样品采集：

依据不同环境样品的采样方法及要求进行样品采集；

2)环境样品PMA处理：

在提取环境样品基因组DNA之前，采用叠氮溴化丙锭PMA对环境样品进行预处理，主要包括：PMA试剂配制与储存；PMA预处理；PMA光交联操作；

其中，2mM PMA试剂配制与储存如下：取PMA溶于MilliQ水，-20℃冰箱避光保存；PMA预处理步骤如下：将2mM PMA试剂解冻，准确量取一定体积的PMA溶液与一定量的环境样品混合，使PMA的终浓度维持在3-4μg/mL，充分混匀后，避光培养15min，每隔4-5min颠倒混匀，使PMA最大限度进入受损细胞；PMA光交联操作：将培养的环境样品置于460nm蓝光交联装置或将样品置于冰上，选用500W卤素灯曝光，时间为18min，距光源距离为20cm进行交联操作，之后进行离心操作；

3)PMA-高通量测序：

取一定量经步骤2)处理的环境样品，使用DNA提取试剂盒，提取基因组DNA，并利用微量紫外分光光度计测定其浓度，进而使用1％琼脂糖凝胶电泳检测抽提基因组DNA的质量；选取细菌16S V3-V4区进行高通量测序分析；测序分析主要包括：根据样品数量，设计合成引物接头、PCR扩增和产物纯化、PCR产物定量和均一化、测序文库构建、上机测序和下机分析；

4)活性非致病菌和致病菌的注释：

通过去除测序原始序列中的低质量序列和嵌合体进行后续分析；有效序列经均一化处理后，进行物种注释，得到环境样品的微生物群落组成信息；基于病原菌毒力因子数据库VFDB提供的病原菌菌属信息从测序结果中将潜在致病菌筛选出来，从而实现活性非致病菌和致病菌的鉴定；

其中，VFDB中的致病菌属包括：Acinetobacter、Aeromonas、Anaplasma、Bacillus、Bartonella、Bordetella、Brucella、Burkholderia、Campylobacter、Chlamydia、Clostridium、Corynebacterium、Coxiella、Enterococcus、Escherichia、Francisella、Haemophilus、Helicobacter、Klebsiella、Legionella、Listeria、Mycobacterium、Mycoplasma、Neisseria、Pseudomonas、Rickettsia、Salmonella、Shigella、Staphylococcus、Streptococcus、Vibrio和Yersinia；

5)ARGs鉴定：

基于PICRUSt对高通量测序获得的细菌16S序列进行分析，得到Kyoto Encyclopediaof Genes and Genomes Orthologs(KOs)数据；进而，建立ARGs-KOs的对应关系：aac-K18816；aac3-VI-K19277；aac(6′)-II-K18815；aac(6′)-Iy-K18816；AacA/AphD-K00663；aacC-K19277；aacC1-K03395；aacC4-K00663；aacC2-K00662；aadA1-K00984；aadE-K05593；spcN-K18844；ampC-K01467/K20319/K20320；bla1-K17836；blaCMY-2–1-K19096；blaCTX-M-14-K17836；blaCTX-M-15-K18767；blaSHV-11-K18699；blaTEM-1-K18698；BlaZ-K18766；cepA-K17836；cfxA-K01624；pbp2X-K12556；pbp5-K18149；penA-K03587；acrF-K18142；adeA/cmeA-K03585；mexD-K18296；catB3-K00638；cmlA1-K18552；cmx-K18553；EmrB/QacA-K03446；mexE-K19586；mexF-K19585；oprJ-K08721；yidY/mdtL-K08163；basR-K07771；qnrA/B/C/D/S-K18555；qepA-K08167；oqxA-K19586；oqxB-K19585；oqxB-K19594；ereA-K06880；erm-34/35/36/ermB/C/F/X-K00561；ermK-K03543；lmrA-K18939；lnuA-K19545；mdtA-K07799；mefA-K08217；MphB-K06979；vgaB-K18231；vgb-K18235；sul1-K18974；sul2-K18824；tetL/K-K08168；tetM/O/W/P/Q/S/T-K18220；tetA-K08151；tetG/H/J-K08151；tetK-K08168；tetV-K18215；tetX-K18221；vanHB-K18347；vanRB-K18344；vanSB-K18345；vanTG-K18348；vanWB-K18346；vanXB-K08641；vanYB-K07260；vanJ-K18353；vanW-K18346；vanS-K18351；vanK-K18354；vraR-K07694；acrR-K03577；catB8-K00638；emrD-K08154；fosX-K21252；marR-K03712；mdtE/yhiU-K18898；mtrCDE-K18991；putitive multidruggene-K07799；EmrB/QacA-K07786；qacEdelta1-K18975；qacH-K03297；sdeB-K19585；emrK-K07797；ttgA-K03585；ttgB-K18324；yceE/mdtG-K08161；yceL/mdtH-K08162；bcr/tcaB-K07552；lmrP-K08152；blt-K08153；TPO1-K08157；MDR1/FLR1/CAF5-K08158；ATR1-K08165；yebQ-K08169；norB/norC-K08170；yitG/ymfD/yfmO-K08221；TC.SMR3-K09771；ebrA-K11814；ebrB-K11815；mdtO-K15547；mdtD-K18326；lmrS-K18934；sdrM-K18935；mdeA-K18936；bmr-K19578；marC-K05595；marB-K13630；ykkC-K18924，从上述数据中将ARGs挑出来，实现对环境样品不同类型抗生素对应ARGs的鉴定；

6)ARGs潜在活性宿主细菌鉴定：

经过步骤3)、4)和5)后，得到环境样品中活性非致病菌、潜在致病菌和ARGs数据，进一步通过网络分析确定ARGs的潜在活性宿主细菌。