[发明专利]一种基于等温扩增-CRISPR/Cas12a技术检测弓形虫的试剂盒及其应用

说明书

本发明提供了一种基于等温扩增‑CRISPR/Cas12a技术检测弓形虫DNA的试剂盒及其应用，属于寄生虫检测技术领域。本发明提供了一种用于特异性检测弓形虫DNA的crRNA，核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。同时本发明还提供了检测弓形虫DNA的试剂盒，包括所述crRNA、Cas12a蛋白和荧光报告基团标记的ssDNA。利用Cas12a靶向切割靶标序列和切割任意单链DNA序列的特性，通过crRNA靶向弓形虫DNA序列，激活Cas12a活性，从而Cas12a对FQ‑ssDNA序列进行酶切，发出的荧光信号来指示检测样品中是否含有弓形虫DNA。所述试剂盒具有操作简便，检测快速的特点，具有较高的应用价值。

技术领域

本发明属于寄生虫检测技术领域，具体涉及一种基于等温扩增-CRISPR/Cas12a技术检测弓形虫的试剂盒及其应用。

背景技术

刚地弓形虫(Toxoplasma gondii NicolleManceaux,1908)是由法国学者Nicolle和Manceaux在突尼斯刚地梳趾鼠的肝脾单核细胞中发现，因其滋养体呈弓形，故简称为弓形虫或弓形体。该虫是一种专性细胞内寄生性原虫，可感染全世界约三分之一的人群及几乎所有的温血动物。猫科动物通常在感染弓形虫后会排泄大量的卵囊，这些卵囊会伴随粪便进入环境并在一定条件下发展成为感染性的孢子化卵囊，从而在环境中造成水源、土壤、瓜果和蔬菜等的污染。人或动物有可能在活动过程中接触被弓形虫卵囊污染的土壤或摄取被卵囊污染的食物或水源而感染。健康的人感染弓形虫后通常处于阴性感染状态，而免疫缺陷的患者感染后，会不同程度地损伤大脑、心脏、眼底等部位，甚至危及生命。此外，孕妇如果受到感染，会通过胎盘经垂直传播给胎儿，导致流产、死胎和畸胎，甚至胎儿会在生长过程中表现出精神疾病以及运动障碍等。

目前弓形虫的实验室诊断方法主要有显微检测、免疫学以及分子生物学三种方法。显微检测技术是一种传统的检测寄生虫的方法。但该方法主要依靠人肉眼识别，因此不仅工作量大而且受工作人员的经验及专业程度影响较大。免疫学诊断方法是诊断弓形虫的重要方法之一，其中包括酶联免疫吸附试验(ELISA)、间接血凝试验(IHA)、间接荧光免疫试验(IFA)、染色试验(DT)等。虽然这些诊断方法具有特异性高和操作简便优点，但同时也存在一些缺点例如敏感性不高以及不能对早期感染进行及时检测。

近年来随着分子生物学的不断发展，分子生物学检测技术也随之应用于弓形虫的分子检测中，例如聚合酶链式反应(PCR)、实时荧光定量PCR、套式PCR等，它们都具有特异性强、灵敏度高等优点。但是，大部分情况下PCR都需要专业的仪器设备和相关技术人员，因此限制了其推广。此外，这些分子检测技术还存在一些弊端，比如成本较高、耗时耗力、操作复杂等。虽然现有技术还开发了新型的检测手段，例如基于CRISPR的检测技术，但是对弓形虫检测而言缺乏特异性强的检测靶点。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种用于特异性检测弓形虫的crRNA，具有较强弓形虫核酸结合特异性。

本发明的目的还在于提供一种基于等温扩增-CRISPR/Cas12a技术检测弓形虫的试剂盒及其应用，具有操作简便，快速，且检测灵敏高的特点。

本发明提供了一种用于特异性检测弓形虫的crRNA，所述crRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明提供了一种基于等温扩增-CRISPR/Cas12a技术检测弓形虫的试剂盒，包括以下组分：

所述crRNA、Cas12a蛋白和荧光报告基团标记的ssDNA。

本发明提供了所述crRNA或所述试剂盒在检测环境中弓形虫中的应用。

优选的，所述环境包括环境土壤以及水源。

优选的，所述弓形虫DNA包括弓形虫卵囊DNA。

本发明提供了基于所述试剂盒检测环境中弓形虫的方法，包括以下步骤：