[发明专利]一种基于等温扩增-CRISPR/Cas12a技术检测弓形虫的试剂盒及其应用

权利要求书

1.一种用于特异性检测弓形虫DNA的crRNA，其特征在于，所述crRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.一种基于等温扩增-CRISPR/Cas12a技术检测弓形虫DNA的试剂盒，其特征在于，包括以下组分：

权利要求1所述crRNA、Cas12a蛋白和荧光报告基团标记的ssDNA。

3.权利要求1所述crRNA或权利要求2所述试剂盒在检测环境中弓形虫DNA中的应用。

4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述环境包括环境土壤、水源。

5.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述弓形虫DNA包括弓形虫卵囊DNA。

6.一种基于权利要求2所述试剂盒检测环境中弓形虫DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)提取环境样品中总DNA；

2)以步骤1)提取的总DNA为模板进行等温扩增，得到扩增产物；

3)将crRNA和Cas12a蛋白混合，孵育，得到核酸蛋白复合物；

4)将所述核酸蛋白复合物与所述扩增产物和荧光报告基团标记的ssDNA溶液混合，孵育，得到反应产物；

5)将所述反应产物测定荧光强度，根据荧光强度的有无判断环境样本中是否含有弓形虫：当检测到荧光强度信号时，表明环境样本中含有弓形虫，反之则不含。

7.根据权利要求6所述方法，其特征在于，步骤3)中crRNA和Cas12a蛋白的摩尔比为1:0.8。

8.根据权利要求6所述方法，其特征在于，步骤4)中所述核酸蛋白复合物、所述扩增产物和荧光报告基团标记的ssDNA溶液的体积比为1:1:1；

所述荧光报告基团标记的ssDNA溶液的浓度为1μM。

9.根据权利要求6所述方法，其特征在于，步骤2)中所述等温扩增包括重组酶介导扩增、环介导等温扩增、依赖核酸序列扩增或重组酶聚合酶扩增。

10.根据权利要求6～9任意一项所述方法，其特征在于，所述环境样本中弓形虫的浓度不低于100copies/μL。