[发明专利]Mog1基因敲除斑马鱼模型及应用

说明书

本发明公开了Mog1基因敲除斑马鱼模型及应用，包括以下步骤：步骤一：取野生型AB系斑马鱼若干条，用循环水1000ml进行培养，一般半天光照时长14h，夜晚时长为10h，每早晚各喂食丰年虫一次；步骤二：准备实验器材和实验溶液若干；步骤三：选取六月龄的野生型AB系斑马鱼10条，雌雄各半，对照组用循环水进行培养，处理组光照时间同上，正常喂食，并每隔2d换一次水，本发明通过使用野生型斑马鱼进行实验，斑马鱼与人类基因同源性高达85％，其信号传导通路与人类基本近似，生物结构和生理功能与哺乳动物高度相似。

技术领域

本发明属于基因敲除技术领域，具体涉及Mog1基因敲除斑马鱼模型及应用。

背景技术

基因(遗传因子)是产生一条多肽链或功能RNA所需的全部核苷酸序列。基因支持着生命的基本构造和性能。储存着生命的种族、血型、孕育、生长、凋亡等过程的全部信息。环境和遗传的互相依赖，演绎着生命的繁衍、细胞分裂和蛋白质合成等重要生理过程。生物体的生、长、衰、病、老、死等一切生命现象都与基因有关。它也是决定生命健康的内在因素。因此，基因具有双重属性：物质性(存在方式)和信息性(根本属性)。

基因敲除(knockout)是用含有一定已知序列的DNA片段与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，整合至受体细胞基因组中并得到表达的一种外源DNA导入技术。它是针对某个序列已知但功能未知的序列，改变生物的遗传基因，令特定的基因功能丧失作用，从而使部分功能被屏蔽，并可进一步对生物体造成影响，进而推测出该基因的生物学功能。

通过采用高分辨率溶解曲线技术对心房颤动患者和正常人进行Mog1基因变异的筛查，结果发现心房颤动患者中有2例Mog1基因产生新变异，因此提出Mog1基因敲除斑马鱼模型及应用，以对心房颤动患者进行治疗。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供Mog1基因敲除斑马鱼模型及应用，以解决上述背景技术中提出的心房颤动患者的Mog1基因产生新变异的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：Mog1基因敲除斑马鱼模型及应用，包括以下步骤：

步骤一：取野生型AB系斑马鱼若干条，用循环水1000ml进行培养，一般半天光照时长14h，夜晚时长为10h，每早晚各喂食丰年虫一次；

步骤二：准备实验器材和实验溶液若干；

步骤三：选取六月龄的野生型AB系斑马鱼10条，雌雄各半，对照组用循环水进行培养，处理组光照时间同上，正常喂食，并每隔2d换一次水；

步骤四：将10条斑马鱼分成5缸，分别交配产卵，收集胚胎，并立即放入Trozal中，并对胚胎进行提取RNA处理；

步骤五：对提取的RNA进行反转录反应，反应分为两部分：基因组去除反应和反转录反应两部分，冰上配置混合液，均匀混合后放入PCR仪中设置程序为42℃，2min；4℃，∞；

步骤六：混合后，放入PCR仪中设置程序为37℃，15min；85℃，5s；4℃，∞，随后取出样本，对样本进行稀释处理，稀释程度为5倍，零下20℃保存；

步骤七：使用PCR专用八联管，保证同一样本同一引物，重复三次，每个引物添加两个空白对照NTC，不加模板，用ddH2O代替，所有操作在冰上完成，将加好的样品在涡旋仪上均匀混合后，放入PCR仪中，设置程序为95℃，5min；95℃，10s；60℃，30s；42℃，45个循环，95℃，10s；65℃，1min；97℃，1s，处理完成后，将样品取出，并进行暂存处理；

步骤八：通过网站查询斑马鱼Mog1基因组DNA外显子序列及其功能区，对样品内进行预测Mog1靶点，依据NCBI数据库中斑马鱼mog1CDS序列，筛选合适位点，查找的斑马鱼mog1基因cDNA序列，选取的TALEN靶点位于斑马鱼mog1基因的第二号外显子内；