[发明专利]Mog1基因敲除斑马鱼模型及应用

权利要求书

1.Mog1基因敲除斑马鱼模型及应用，其特征在于：包括以下步骤：

步骤一：取野生型AB系斑马鱼若干条，用循环水1000ml进行培养，一般半天光照时长14h，夜晚时长为10h，每早晚各喂食丰年虫一次；

步骤二：准备实验器材和实验溶液若干；

步骤三：选取六月龄的野生型AB系斑马鱼10条，雌雄各半，对照组用循环水进行培养，处理组光照时间同上，正常喂食，并每隔2d换一次水；

步骤四：将10条斑马鱼分成5缸，分别交配产卵，收集胚胎，并立即放入Trozal中，并对胚胎进行提取RNA处理；

步骤五：对提取的RNA进行反转录反应，反应分为两部分：基因组去除反应和反转录反应两部分，冰上配置混合液，均匀混合后放入PCR仪中设置程序为42℃，2min；4℃，∞；

步骤六：混合后，放入PCR仪中设置程序为37℃，15min；85℃，5s；4℃，∞，随后取出样本，对样本进行稀释处理，稀释程度为5倍，零下20℃保存；

步骤七：使用PCR专用八联管，保证同一样本同一引物，重复三次，每个引物添加两个空白对照NTC，不加模板，用ddH₂O代替，所有操作在冰上完成，将加好的样品在涡旋仪上均匀混合后，放入PCR仪中，设置程序为95℃，5min；95℃，10s；60℃，30s；42℃，45个循环，95℃，10s；65℃，1min；97℃，1s，处理完成后，将样品取出，并进行暂存处理；

步骤八：通过网站查询斑马鱼Mog1基因组DNA外显子序列及其功能区，对样品内进行预测Mog1靶点，依据NCBI数据库中斑马鱼mog1CDS序列，筛选合适位点，查找的斑马鱼mog1基因cDNA序列，选取的TALEN靶点位于斑马鱼mog1基因的第二号外显子内；

步骤九：确定好TALEN靶点后，利用TALENs质粒构建试剂盒构建TALENs质粒，针对同一靶点分别构建三条左臂和两条右臂，可以有六种不同左右臂组合，提高TALENs识别和敲除效率；

步骤十：用限制性内切酶NotⅠ线性化TALENs质粒，电泳检测，采用快速DNA回收试剂盒回收；SP6体外转录试剂盒进行TALENs体外转录成mRNA，氯化裡沉淀回收，检测mRNA浓度和质量，储存于-80℃备用；

步骤十一：注射前，按照100pg/nL、160pg/nL、200pg/nL的不同浓度将三条左臂和两条右臂分别混合，共有六种组合方式，三种浓度梯度，分别注射斑马鱼1-2细胞期胚胎，，48hpf，显微镜下取表行正常的胚胎提取DNA，利用引物mog1-F-1和mog1-R-1进行PCR扩增，扩增WT片段长度为455bp，利用引物mog1-F-2测序，依据测序结果判断不同TALENs组合及不同浓度的基因敲除效率，最终确定注射浓度为160pg/nl的浓度，利用效率最高的一对左右臂组合注射WT斑马鱼胚胎，获得F0代mog1敲除斑马鱼；

步骤十二：将F0代Mog1敲除斑马鱼饲养至3月龄，剪鱼尾，提DNA,利用引物mog1-F-1和mog1-R-1进行PCR扩增，扩增WT片段长度为455bp，利用引物mog1-F-2测序，根据测序结果确定有效敲除Mog1基因的F0代斑马鱼个体，分别与WT斑马鱼杂交，获得F1代mog1敲除斑马鱼系，将F1代mog1敲除斑马鱼饲养至3月龄，剪尾鳍提取DNA进行PCR扩增，测序确定是否是mog1敲除的杂合子，F1代中杂合子与WT斑马鱼杂交获得的胚胎为F2代mog1敲除斑马鱼，将F2代mog1敲除斑马鱼饲养至3月龄，剪尾鳍提取DNA进行PCR扩增，测序确定是否是mog1敲除的杂合子，F2代杂合子杂交，剪尾鳍提取DNA进行PCR扩增，测序确定是否是mog1敲除的纯合子获得的纯合子即为F3代mog1敲除斑马鱼，将F3代mog1敲除斑马鱼自交，获得mog1敲除纯合子胚胎，提取基因组DNA，扩增mog1片段，检测mog1在基因组水平是否被有效敲除，依据测序结果，获得两种类型的mog1基因敲除模型，基因组DNA第二号外显子分别缺失5bp和22bp，命名为Δ5和Δ22mog1基因敲除模型。

2.根据权利要求1所述的Mog1基因敲除斑马鱼模型及应用，其特征在于：所述步骤一中，循环水中包含8.4gCaSO₄、75gNaHCO₃和18gNaCl，水温为28.5±0.5℃，循坏水的PH值在7.2左右，水质总硬度62mg/L，电导率485μS。